RAG1基因新發(fā)變異致重癥聯(lián)合免疫缺陷1例報(bào)告及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

崔清洋，王夢(mèng)斌，曹銀利，唐成和

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 兒科，河南 衛(wèi)輝 453100)

原發(fā)性免疫缺陷病(primary immunodeficiency diseases, PIDs)為一類和遺傳緊密關(guān)聯(lián)的異質(zhì)性疾病， 患兒易患反復(fù)感染、腫瘤、過敏或自身免疫性疾病等。最新版的PIDs分類已在2020年1月17日由國際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)專家委員會(huì)發(fā)表，分為10大類，包括430種PIDs。其中同時(shí)影響細(xì)胞和體液免疫缺陷的第2亞類T-B-NK+SCID的原RAG1缺陷和RAG2 缺陷現(xiàn)在統(tǒng)稱為RAG缺陷。

重癥聯(lián)合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency, SCID)是一類細(xì)胞免疫的缺陷、同時(shí)累及體液免疫的PID，SCID發(fā)生率約為1/100 000活產(chǎn)新生兒[1]，而一項(xiàng)使用美國11個(gè)州的新生兒SCID篩查數(shù)據(jù)的研究發(fā)現(xiàn)，SCID發(fā)病率為1/58 000活產(chǎn)新生兒，包括典型SCID、泄漏型SCID和Omenn綜合征[2]。此疾病一般具有明確的致病機(jī)制及干預(yù)治療靶點(diǎn)，其遺傳方式為常染色體隱性遺傳，其中IL2RG基因變異所致 X 連鎖聯(lián)合免疫缺陷(X-linked severe combined immunodeficiency, SCID -XL)占 50%～60%(其中共用受體 γ 鏈基因缺陷是導(dǎo)致 SCID -XL最主要的形式，約占所有 SCID50%)，重組激活基因(recombinase activating gene，RAG)變異(包括RAG1和RAG2)所致的聯(lián)合免疫缺陷病占10%。SCID發(fā)病所涉及的基因有ADA、AK2、LIG4、NHEJ1、PRKDC、DCLRE1CRAG2、RAG1、CORO1A、LAT、CD247、CD3E、CD3D、PTPRC、IL7R、IL2RA、JAK3及IL2RG(其中IL2RG基因變異為X連鎖，其余為常染色體隱性遺傳)。

大部分SCID患兒出生時(shí)無明顯異常，但隨胎傳抗體的消耗，患兒很容易在出生的第3～6月齡發(fā)生嚴(yán)重的反復(fù)感染，包括遷延性腹瀉、口腔念珠菌感染、嚴(yán)重中耳炎、間質(zhì)性肺炎及條件致病微生物如肺孢子蟲和巨細(xì)胞病毒等感染，絕大部分患兒伴有生長發(fā)育遲緩[3]。若不及時(shí)糾正免疫缺陷，大部分患者在2歲以內(nèi)因重癥感染而死亡[4]，為兒科醫(yī)生必須面對(duì)的臨床急癥。

SCID通常基于缺陷的淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行分類，可分為以下4類：T-B+NK+、T-B+NK-、T-B-NK+、T-B-NK-等，其中85%～90%的SCID患兒伴有已知的分子缺陷[5-6]。與T-B-NK+免疫表型有關(guān)的基因有DCLRE1C，LIG4，NHEJ1，PRKDC，XRCC4，RAG1，RAG2等，而T-B-NK+SCID約占SCID所有病例的25%。

本文回顧性分析1例嬰兒SCID患兒的臨床資料及基因檢測結(jié)果，且RAG1基因的c.2428A>G雜合錯(cuò)義變異為國際首次報(bào)道及c.1229G>A雜合錯(cuò)義變異為國內(nèi)首次報(bào)道，以期加強(qiáng)對(duì)本病的認(rèn)識(shí)。

1 臨床資料

女性患兒，1個(gè)月6天，因發(fā)現(xiàn)體質(zhì)量不增半月余于2020年1月26日入院。半月余前發(fā)現(xiàn)患兒體質(zhì)量不增，進(jìn)乳可，大便4～5次/d，呈黃色糊狀。G1P1，胎齡42周時(shí)因“胎兒宮內(nèi)窘迫”剖宮產(chǎn)出生，出生體質(zhì)量3 500 g，出生時(shí)有重度窒息史，羊水Ⅲ度污染，但無產(chǎn)傷史。出生1小時(shí)后因呼吸困難轉(zhuǎn)入我院新生兒科，入院時(shí)血常規(guī)(2020-01-26)未見異常，見表1。予抗感染、營養(yǎng)腦細(xì)胞、靜脈營養(yǎng)及合理喂養(yǎng)等治療15天后好轉(zhuǎn)出院。父母體健，非近親結(jié)婚。入院體格檢查：體質(zhì)量3 500 g，一般情況尚可，發(fā)育不良，營養(yǎng)不良，體型偏瘦，心肺腹未見異常，四肢肌張力增高，四肢肌力正常。專科檢查：語言及智能評(píng)估：會(huì)哭；仰臥位：頭可居于中線，追視追聽欠佳，雙手不可居于中線位活動(dòng)，雙下肢屈曲，非對(duì)稱型緊張性頸反射(ATNR)姿勢(shì)存在；俯臥位：被動(dòng)肘支撐，不可瞬間抬頭；坐位：全前傾坐位；立位：踏步反射存在，雙下肢可支撐體質(zhì)量；手抓位：拇指內(nèi)收；肌張力：四肢肌張力增高；關(guān)節(jié)活動(dòng)度：股角60度，腘窩角120度，足背屈角30度，圍巾征不過中線，跟耳征陰性。入院診斷：蛋白質(zhì)-能量營養(yǎng)不良。輔助檢查：甲狀腺功能三項(xiàng)未見異常；血常規(guī)(2020-03-05)示粒細(xì)胞缺乏，見表1；大便常規(guī)潛血陽性；入院第2天患兒出現(xiàn)發(fā)熱，超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)22.31 mg/L；胸片示支氣管肺炎；復(fù)查hs-CRP 43.05 mg/L，白細(xì)胞介素6(IL-6)48.67 pg/ml，降鈣素原(PCT)0.90 ng/ml，連續(xù)復(fù)查2次血常規(guī)(2020-03-06和2020-03-09)均提示粒細(xì)胞缺乏或減少，見表1。予康復(fù)、先后予頭孢替安及頭孢他啶抗感染及降溫對(duì)癥治療后患兒仍反復(fù)發(fā)熱，升級(jí)抗生素為美羅培南加強(qiáng)抗感染后發(fā)熱緩解，奶量可，但監(jiān)測體質(zhì)量有下降趨勢(shì)，復(fù)查hs-CRP仍無明顯下降，予丙種球蛋白(IVIG)增強(qiáng)機(jī)體免疫力，因不排除血液系統(tǒng)惡性疾病，進(jìn)一步檢查：自身抗體14項(xiàng)陰性，人微小病毒B19-DNA、EBV-DNA及人巨細(xì)胞病毒DNA均陰性。血培養(yǎng)及骨髓培養(yǎng)均陰性；網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)76.81×109/L，網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比0.03；骨髓穿刺結(jié)果示：①骨髓有核細(xì)胞增生活躍，粒系占66%，紅系占22%，粒:紅=3.0；②粒系增生活躍，比值增高，部分細(xì)胞胞體脹大，漿內(nèi)顆粒增多增粗，中性分葉核粒細(xì)胞缺如；③紅系增生活躍，比值及形態(tài)可；④淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞比例增高；⑤血小板易見。乳酸2.9 mmo/L；血氨34.8 mmo/L；血串聯(lián)質(zhì)譜及尿有機(jī)酸分析未見異常；復(fù)查肝功能：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)365 U/L，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)302 U/L，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶150 U/L，總膽汁酸(TBA)17.16 μmol/L；淋巴細(xì)胞亞群示：淋巴細(xì)胞3.66%(40%～60%)，總T淋巴細(xì)胞(CD3+)56.07%(60%～84%)，CD3+CD8+19.53%(20%～35%)，CD3+CD4+36.26%(36%～55%)，CD3+CD4+CD8+0.31%(0～5%)，CD3+CD4+/CD3+CD8+1.86%(0.8%～2.6%)，CD19+B淋巴細(xì)胞41.48%(8%～28%)，CD3+CD56+T-NK細(xì)胞1.96%，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)430×106/L，總T淋巴細(xì)胞(CD3+)241×106/L，CD3+CD8+84×106/L，CD3+CD4+156×106/L，CD19+B淋巴細(xì)胞13×106/L ，CD3+CD56+T-NK細(xì)胞178×106/L，符合T-B-NK+免疫表型。排除白血病及再障和遺傳代謝病，予調(diào)整抗生素、保肝及粒細(xì)胞刺激因子升高粒細(xì)胞治療后患兒未再發(fā)熱，體質(zhì)量緩慢增加，白細(xì)胞升高(但容易再次下降)，住院期間患兒出現(xiàn)腹脹，腹部X線立臥位平片示腹部部分腸管擴(kuò)張并積氣；予生理鹽水回流灌腸腹脹減輕后鋇劑灌腸提示直腸痙攣狹窄，建議隔期復(fù)查除外先天性巨結(jié)腸。住院38天后患兒家屬要求出院轉(zhuǎn)上級(jí)醫(yī)院進(jìn)一步治療。出院診斷：①重度熱能營養(yǎng)不良；②支氣管肺炎；③肝損傷；④不完全性腸梗阻；⑤重度貧血；⑥膿毒血癥；⑦中毒性腸麻痹；⑧先天性巨結(jié)腸？⑨直腸狹窄。

表1 血常規(guī)變化情況

因患兒多次血常規(guī)提示粒細(xì)胞減少甚至缺乏，考慮先天性中性粒細(xì)胞缺乏癥可能，在獲得家長知情同意后，采集患兒及父母的外周血行基因檢測。RAG基因exon2引物為：正向引物序列 CCTGGAGAGTC CAG TG AAG TCC； TGCCAGGCTACC AC C ACTTT；反向引物序列 AGCCAG CAGG AACA AGGTCA； GAGAATGCCT CCC A GCTCAA。擴(kuò)增條件為：①預(yù)變性:95 ℃，10 min；②變性(35個(gè)循環(huán)):95 ℃，30 s；③退火(35個(gè)循環(huán)):60 ℃，30 s；④延伸(35個(gè)循環(huán)):72 ℃，45 s；⑤徹底延伸(35個(gè)循環(huán)):72 ℃，5 min。

測序分析發(fā)現(xiàn)患兒RAG1基因第2外顯子分別為存在c.1229G>A(p.Arg410Gln)、c.2428A>G(p.Ile810Val)錯(cuò)義變異(母源性)和c.2005G>A(p.Glu669Lys)的錯(cuò)義變異(父源性)，見圖1～3。上述變異可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能受到影響，c.1229G>A及c.2005G>A變異的致病性已有文獻(xiàn)報(bào)道，但c.2428A>G變異的致病性未見報(bào)道(所參考數(shù)據(jù)庫： HGMD Pro、 PubMed及ClinVar)，且c.1229G>A雜合變異為國內(nèi)首次報(bào)道。上述的變異不屬于多態(tài)性變化，在人群中發(fā)生頻率極低(所參考數(shù)據(jù)庫 1000Genomes及dbSNP)。家系驗(yàn)證結(jié)果顯示，患兒c.1229 G>A和c.2428A>G來自母親，c.2005G>A來自父親，為復(fù)合雜合變異，符合常染色體隱性遺傳規(guī)律。

圖1 RAG基因c.1229G>A變異測序峰圖 a、b及c分別為患兒和父母，箭頭示突變位點(diǎn)

圖2 RAG基因c.2428A>G變異測序峰圖 a、b及c分別為患兒和父母，箭頭示突變位點(diǎn)

圖3 RAG基因c.2005G>A變異測序峰圖 a、b及c分別為患兒和父母，箭頭示突變位點(diǎn)

根據(jù)文獻(xiàn)[7]進(jìn)行致病性分析：①RAG1基因 c.1229G>A變異的證據(jù)強(qiáng)度為“PS1+PM1+PM2+PM3+PP3”，判斷為致病性的變異；②RAG1基因c.2005G>A變異的證據(jù)強(qiáng)度為“PS1+PM2+PM3+PP3+PP5”，判斷為致病性的變異；③RAG1基因c.2428A>G變異的證據(jù)強(qiáng)度為“PM2+PM3+PP3”，判斷為臨床意義不明的變異，但亦未有無致病性的定論，需待日后進(jìn)一步行相關(guān)驗(yàn)證。

RAG1基因序列全長為1 043個(gè)氨基酸，包括478個(gè)alpha-helix，121個(gè)extended strand，56個(gè)beta-turn，388個(gè)Random coil。各種二級(jí)結(jié)構(gòu)所占的百分比為alpha-helix占45.83%，extended strand占11.6%， beta turn占5.37%，random coil占37.2%。c.1229G>A(p.Arg410Gln)，導(dǎo)致第410號(hào)氨基酸由精氨酸變成了谷氨酰胺；c.2428A>G(p.Ile810Val)，導(dǎo)致第810號(hào)氨基酸由異亮氨酸變成了纈氨酸；c.2005 G>A(p.Glu669Lys)，導(dǎo)致第669號(hào)氨基酸由谷氨酸變成了賴氨酸。該3個(gè)變異均發(fā)生在RAG1蛋白家族結(jié)構(gòu)域中，RAG1蛋白家族是RAG1-RAG2 V(D)J復(fù)合酶復(fù)合物的兩個(gè)不同組分之一。RAG復(fù)合物由RAG1蛋白和RAG2蛋白組成，是一種多蛋白復(fù)合體，在V(D)J重組過程中介導(dǎo)DNA裂解，其中RAG1介導(dǎo)DNA-binding結(jié)合到保守重組信號(hào)序列(RSS)上，氨基酸的改變可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能受到影響，見圖4～5。

圖4 c.1229G>A、c.2428A>G及c.2005 G>A變異位點(diǎn)(b)及變異前的位置(a)

圖5 c.1229G>A、c.2428A>G及c.2005 G>A變異位點(diǎn)(b、d及f)及變異前的位置(a、c及e)

結(jié)合患兒臨床表現(xiàn)及基因檢測分析診斷RAG1基因c.2005G>A、c.1229G>A及c.2428A>G所致的SCID基本明確，告知患兒家屬目前該病最有效的治療措施為造血干細(xì)胞移植，家屬考慮中，隨訪患兒一般情況暫時(shí)尚可。

2 討 論

RAG1基因定位于11p12，基因組全長約11.73 kb，包含2個(gè)外顯子，外顯子長度約6 564 bp，編碼1 043個(gè)氨基酸。目前RAG1基因變異類型多為錯(cuò)義變異，其次為無義變異、堿基缺失和插入變異，尚無變異類型與臨床類型關(guān)系報(bào)道，但臨床上純合變異較復(fù)合雜合變異癥狀重，本例患兒RAG1基因3個(gè)變異位點(diǎn)均為錯(cuò)義變異，且予以升級(jí)抗生素及IVIG和粒細(xì)胞刺激因子治療后癥狀改善，支持文獻(xiàn)報(bào)道。RAG1基因氨基末端區(qū)域有核定位的信號(hào)，尤其是4個(gè)堿性區(qū)域BI、BIIa、BIIb及BIII，是核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SRPI的靶點(diǎn)。另外2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域C3HC4及C2H2參與RAG1蛋白二聚體的形成。RAG1蛋白的中心區(qū)域有2個(gè)顯著保守的功能域，1個(gè)氨基酸殘基區(qū)域，識(shí)別重組信號(hào)序列(RSSs)，將RAG1-RAG2的蛋白復(fù)合體錨定在RSSs區(qū)。另一個(gè)氨基酸的殘基區(qū)域是重組酶活性區(qū)域，與RAG2蛋白相互作用的功能域定位于其他氨基酸殘基區(qū)域，包括活性中心和羧基末端區(qū)域。

RAG為Ig及TCR基因片段重排所必需，RAG1基因變異造成其編碼的重組酶活性完全或部分喪失，V(D)J重組失衡，T及B淋巴細(xì)胞發(fā)育在早期為阻斷而致PID發(fā)病。RAG1蛋白核心的氨基酸區(qū)域是387-1008，其編碼產(chǎn)物Rag1蛋白所形成的復(fù)合物為最重要的重組酶之一。該基因完全變異造成功能喪失，阻斷V(D)J重組，致成熟的B及T細(xì)胞功能完全喪失。

V(D)J基因片段的重組為RAG1或RAG2所誘發(fā)，其核酸內(nèi)切酶誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂。由非同源的末端連接蛋白對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)，該過程 至少包括5個(gè)蛋白，即Artemis、LIG4、XRCC4、DNA-PKcs和Ku70/80[8]，這些分子的缺陷均可導(dǎo)致 T-B-NK+SCID發(fā)生。

如果不是新生兒篩查發(fā)現(xiàn)，T-B-NK+SCID患兒在生命的早期會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重到危及生命的感染、發(fā)育不良、T和B細(xì)胞數(shù)量和功能低下或缺失、NK細(xì)胞數(shù)量和功能正常。T-B-NK+SCID可由編碼抗原受體基因V(D)J重組蛋白的任何一個(gè)基因的常染色體隱性缺陷引起。重組過程隨機(jī)組合可變的、多樣性的和連接的基因片段，這些片段分別編碼TCR和免疫球蛋白基因。這些基因編碼的一些蛋白質(zhì)也參與了人體所有細(xì)胞的DNA修復(fù)。這些基因的缺陷與額外的免疫表型有關(guān)，包括生長發(fā)育異常以及對(duì)電離輻射和化療的敏感性增高。

與V(D)J重組相關(guān)的T-B-NK+SCID主要有兩種類型：有或無放療/化療敏感性的患者。其類型取決于缺陷基因是否同時(shí)參與V(D)J重組和DNA修復(fù)或重組。RAG1或RAG2基因的嚴(yán)重變異可致無輻射敏感性的T-B-NK+SCID，因RAG1和RAG2基因只參與V(D)J重組，而不參與DNA修復(fù)；某些RAG基因變異導(dǎo)致部分蛋白表達(dá)和T、B細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)量受限但臨床表現(xiàn)較為明顯，稱為Omenn綜合征。Omenn綜合征也為一種T-B-NK+SCID，盡管它是一種產(chǎn)生無功能T和B細(xì)胞的泄漏型SCID，因此可能表現(xiàn)為T+B+NK+SCID或輕度聯(lián)合免疫缺陷。B-NK+SCID另一類型是輻射敏感性的SCID(RS-SCID)，其中包括阿薩巴斯卡SCID(SCID-A)，在講阿薩巴斯卡語的美洲土著人中發(fā)現(xiàn)。RS-SCID主要由DCLRE1C基因變異引起，但也可以在涉及基因PRKDC、LIG4、NHEJ1和NBS1變異中發(fā)現(xiàn)，所有這些都是NHEJDNA修復(fù)所必需的。

SCID臨床上可分為典型SCID，如果不太嚴(yán)重，則根據(jù)T細(xì)胞定性和定量缺陷的嚴(yán)重程度分為泄漏型SCID。新生兒篩查或家族史診斷為SCID的嬰兒在出生時(shí)和嬰兒早期表現(xiàn)正常。新生兒期未確診的SCID患者的典型癥狀是反復(fù)嚴(yán)重感染、慢性腹瀉和發(fā)育不良。在缺乏以人群為基礎(chǔ)的新生兒SCID篩查的情況下，通常直到嬰兒出現(xiàn)一種或多種嚴(yán)重感染才會(huì)做出診斷。大多數(shù)SCID患兒的胸片上沒有胸腺陰影，淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)通常很低。典型SCID定義為自體T細(xì)胞計(jì)數(shù)<300×106/L，體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(PHA)反應(yīng)<正常的10%，泄漏型SCID是指淋巴細(xì)胞減少(2歲以下的自體T細(xì)胞計(jì)數(shù)<1 000×106/L，2～4歲<800×106/L，或4歲以上<600×106/L)，PHA反應(yīng)<30%正常。該患兒自體T淋巴計(jì)數(shù)241×106/L，小于300×106/L，符合典型SCID定義，其在第1次住院時(shí)(即新生兒期)一般抗感染治療有效，白細(xì)胞明顯降低，考慮為一過性。第2次因發(fā)育不良住院，且在新生兒期之后出現(xiàn)不易控制的感染，支持上述文獻(xiàn)報(bào)道。但該患兒胸片可見胸腺影，與上述文獻(xiàn)略有不同。

對(duì)于SCID家庭及高危孕婦應(yīng)加強(qiáng)遺傳咨詢，更重要的是進(jìn)行必要的產(chǎn)前診斷，其一可早期采取措施減少SCID患兒的出生，其二也有利于醫(yī)護(hù)人員為有缺陷患兒出生后提供及時(shí)而有效的診治做好必要的準(zhǔn)備。

SCID的初始管理為預(yù)防感染，包括與潛在的疾病接觸者隔離、免疫球蛋白替代療法、開始抗菌預(yù)防和避免使用活病毒疫苗。而大多數(shù)SCID最常見、最普遍及最有效的治療方法是來自匹配良好的健康異基因供體的造血細(xì)胞移植。這種治療有很好的整體生存率，重建T細(xì)胞免疫，在許多情況下，B細(xì)胞免疫及腺苷脫氨酶(ADA)缺乏可采用酶替代療法。如果沒有人類白細(xì)胞抗原(HLA)相同的供體，基因治療在某些形式的SCID中是一種越來越有效和成功的替代方案。但遺憾的是，相當(dāng)一部分患兒因經(jīng)濟(jì)和配型困難等原因，往往在造血細(xì)胞移植前死亡。

盡管依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)和美國分子病理學(xué)會(huì)(AMP)“基因序列變異的解釋標(biāo)準(zhǔn)和指南”進(jìn)行致病性分析顯示尚無法明確c.2428A>G變異位點(diǎn)的致病性，但c.2428A>G不屬于多態(tài)性變化，在人群中發(fā)生的頻率極低(所參考的數(shù)據(jù)庫 dbSNP及1000Genomes)，為進(jìn)一步明確RAG1基因c.2428A>G變異位點(diǎn)的致病性，需要進(jìn)一步大樣本回歸分析并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型驗(yàn)證。患兒有SCID典型的臨床表現(xiàn)，故綜合考慮基因結(jié)果及患者癥狀和家族史等信息，可確認(rèn)c.2005G>A及c.1229G>A變異位點(diǎn)為患兒的致病性變異，擴(kuò)充了SCID國際上的基因變異譜。