黃腐酸鈉預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用及其機制研究

宋健康 李鐵成(通信作者)

124010 錦州醫科大學盤錦遼油寶石花醫院研究生培養基地1，遼寧盤錦

121000 錦州醫科大學附屬第三醫院2，遼寧錦州

以急性心肌梗死為代表的缺血性心臟病嚴重危害著人們的生命健康，死亡率位居世界第一。目前以冠狀動脈介入重新恢復血液灌注療效最為顯著，然而阻塞的血管血流再通后可能會引起原有缺血心肌組織損害進一步加重的現象，臨床上稱為心肌缺血再灌注損傷(MIRI)[1]。這種再灌注后所帶來不可預估的心肌二次損害，給醫療工作人員帶來很大困擾。黃腐酸鈉具有較強的抗炎、抗氧化作用，并有活血化瘀、改善微循環的功效[2]。黃腐酸鈉在I/R誘導的組織損傷中具有有益作用，特別是在肝、腦組織中，但是尚無研究證明黃腐酸鈉對心臟是否同樣會起到保護作用。本文中構建I/R大鼠心肌損傷模型，通過預處理的方式來探討黃腐酸鈉保護作用及機制，現報告如下。

材料與方法

試驗動物：選取50 只健康的SD 大鼠，重量200～250 g，均為雄性，正常喂養；試驗動物為錦州醫科大學生物試驗室提供。

主要試劑：黃腐酸鈉，有效物質含量99%，批號：Z41020418，訂購于山西省呂梁市盛大生物發展有限公司；其他試劑由錦州醫科大學生命科學院試驗室提供。

方法：①分組及給藥：將50 只大鼠隨機平均分為五組，每組10 只。I/R 模型組：結扎左前降支(LAD)進行30 min局部缺血，然后保持120 min的穩定灌注。黃腐酸鈉高、中、低劑量預處理組：黃腐酸鈉組按其各自劑量，于術前1 周用黃腐酸鈉水溶制劑灌胃預處理，1 次/d，其他操作同I/R 模型組。假手術組：假手術的大鼠進行與I/R 模型組完全相同的程序，除了在LAD 下通過的縫合線保持不結扎狀態。各組大鼠均在術前12 h 禁食不禁飲。②MIRI 模型建造：依據文獻方法，以20%烏拉坦0.5 mL/100 g 的劑量進行大鼠腹腔注射麻醉，麻醉后將大鼠取仰臥位固定于操作臺，行氣管插管并連接動物呼吸機(頻率60 次/min，潮氣量15 mL/kg)，插入針型電極于四肢皮下進行心電監測[3]。剃除胸部鼠毛并進行消毒，隨后由胸骨左緣心搏最明顯處縱向切開皮膚，彎鉗鈍性分離肌肉組織，暴露肋骨之后將3～5 肋剪斷，剝離心包充分暴露心臟，將4-0帶針絲線穿過冠狀動脈左前降支(LAD)下方后，將一個小的1 mm聚乙烯管(PE)放在LAD頂部，并將縫合線結扎在PE管的頂部，而不會損壞動脈。手術全程心電監護，根據心電圖及左室前壁心肌顏色變化來判斷造模成功與否。結扎后心電圖顯示出相應的ST 段升高，伴隨著左心室顏色逐漸變暗可確認缺血；缺血30 min 后，通過切開該PE管頂部的線結去除結扎，觀察缺血區心肌恢復紅潤和ST 段回落幅度高于50%的改變確認再灌注。③造模結果：試驗中各組均有l～2 只大鼠由于心室顫動、大出血及氣胸等因素死亡，將其排除，其他剩余每組8只大鼠進行相關試驗室指標檢測。④標本采集：再灌注120 min 后，立即游離頸總動脈，于頸總動脈處取血并摘取大鼠心臟。血液裝于試管中進行離心(3 000 r/min，10 min)，采血清于EP 管中冷藏保存備用。⑤指標檢測：檢測心肌梗死面積(NBT 染色)；對心肌組織進行形態學觀察；測定相關的血清指標：應用全自動生化分析儀(日本東芝公司，TBA-120)測定肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白T(cTnT)含量；使用試劑盒對血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)行分析，其中SOD、MDA 試劑盒是購買自南京建成生物工程研究所，而IL-6和TNF-α含量檢測試劑盒購買自RD公司。

統計學方法：數據采用SPSS 18.0軟件分析；計量資料以(±s)表示，采用t檢驗；P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

心肌梗死面積：與假手術組比較，I/R 模型組梗死面積增加，差異有統計學意義(P＜0.05)；說明MIRI大鼠模型構建成功；與I/R模型組比較，黃腐酸鈉各組心肌梗死面積均縮小，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 心肌梗死面積

心肌組織形態學改變：假手術組心肌紋理規整清晰，心肌纖維排列整齊，細胞正常無水腫、出血跡象，無炎性細胞浸潤。I/R 模型組心肌纖維扭曲雜亂，心肌細胞水腫并伴有變性和壞死，存在部分炎性細胞浸潤。黃腐酸鈉各組心肌組織的結構形態介于I/R模型組和假手術組之間，并且炎性細胞浸潤有所減輕，見圖2。

圖2 心肌組織形態學改變

各組大鼠血清CK-MB和cTnT含量比較：與假手術組相比，I/R 模型組血清CK-MB 和cTnT 含量增加，差異有統計學意義(P＜0.05)；與I/R 模型組相比，黃腐酸鈉各劑量組CK-MB和cTnT水平降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；且呈劑量依賴性。見表1。

表1 各組大鼠血清CK-MB和cTnT含量比較(±s)

表1 各組大鼠血清CK-MB和cTnT含量比較(±s)

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與I/R模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量(mg/kg) CK-MB(U/L) cTnT(pg/mL)假手術組 8 39.46±3.96 406.51±27.50 I/R模型組 8 112.35±6.21* 1652.37±202.21*黃腐酸鈉低劑量組 50 103.02±8.60# 1554.45±139.34#黃腐酸鈉中劑量組 100 78.82±8.19# 1264.26±111.80#黃腐酸鈉高劑量組 150 63.15±8.21# 1022.19±129.12#

各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平比較：與假手術組相比，I/R 模型組IL-6 和TNF-α水平提高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與I/R 模型組相比，黃腐酸鈉各劑量組IL-6和TNF-α水平顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；且呈劑量依賴性。見表2。

表2 各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平比較(±s)

表2 各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平比較(±s)

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與I/R模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量(mg/kg) IL-6(pg/mL) TNF-α(pg/mL)假手術組 8 106.48±9.13 32.50±2.91 I/R模型組 8 187.84±8.96* 92.83±7.74*黃腐酸鈉低劑量組 50 172.33±9.19# 78.81±7.49#黃腐酸鈉中劑量組 100 152.05±15.06# 68.39±8.32#黃腐酸鈉高劑量組 150 144.14±13.79# 53.65±3.38#

各組大鼠血清SOD 活性和MDA 含量比較：與假手術組相比，I/R模型組SOD活性減少且MDA含量提高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與I/R 模型組相比，黃腐酸鈉各劑量組SOD 活性均升高，而MDA 含量下降，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清SOD活性和MDA含量比較(±s)

表3 各組大鼠血清SOD活性和MDA含量比較(±s)

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與I/R模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量(mg/kg) SOD(U/mL) MDA(μg/uL)假手術組 8 50.94±4.67 39.50±4.54 I/R模型組 8 20.60±3.06* 94.85±7.36*黃腐酸鈉低劑量組 50 24.82±4.09# 79.71±9.37#黃腐酸鈉中劑量組 100 33.87±4.30# 73.77±6.35#黃腐酸鈉高劑量組 150 36.72±6.13# 64.24±7.28#

討 論

cTnT和CK-MB是目前臨床上比較認可的心肌損傷標志物，對于診斷心肌梗死、評價溶栓效果及再灌注損傷程度具有重要意義[4]。本試驗中黃腐酸鈉預處理可以降低CK-MB、cTnT 含量，并且心肌梗死面積較模型組顯著減少，證實黃腐酸鈉能夠改善心肌損傷情況。同時，黃腐酸鈉各劑量組的心肌纖維排列規整，炎性細胞浸潤減少，提示黃腐酸鈉預處理可以減輕再灌注后心肌組織形態損傷的程度[5]。

心肌組織擁有氧耗高且不可再生的特性，當機體組織缺血缺氧時，SOD活性被抑制，脂質過氧化反應生成具有細胞毒性的產物MDA，并導致中性粒細胞激活和炎癥細胞因子TNF-α和IL-6的釋放，引起心肌組織的損傷[6]。研究顯示，藥物預處理能夠提高血清中SOD的活性，改善機體氧自由基產生與清除的平衡狀態，從而很好地減輕組織細胞所受到的傷害[7]。本研究發現，黃腐酸鈉預處理組可以使缺血區域心肌組織血清中SOD 活性增強，MDA、TNF-α、IL-6 水平降低，說明黃腐酸鈉能夠減輕氧化應激并抑制炎性反應，從而起到對心肌的保護作用。

綜上所述，黃腐酸鈉預處理可以保護心臟免受I/R損傷，其作用機制與抑制氧化應激及炎性因子的釋放相關聯。