康柏西普對DME患者黃斑部微循環(huán)的影響

符樹宇，黃雄高，胡衛(wèi)文，唐吉森，陳又珍，劉 亮

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病性微血管病變中最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，而DR患者視力障礙最主要的原因則是糖尿病性黃斑水腫(DME)[1]，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)已被證實在DME的發(fā)病過程中起著重要作用，玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF藥物治療DME已廣泛應(yīng)用于臨床。有報道顯示玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF藥物會引起視網(wǎng)膜動脈或靜脈收縮、黃斑中心凹無血管區(qū)擴大等情況[2]，提示抗VEGF藥物可能會導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血加重。目前對于抗VEGF藥物是否會引起視網(wǎng)膜缺血加重仍未有統(tǒng)一的觀點，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)使用抗VEGF藥物后視網(wǎng)膜微循環(huán)變化與房水因子的改變相關(guān)[3]。血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)作為缺血性視網(wǎng)膜病變的相關(guān)生物標(biāo)記物，可從細(xì)胞因子層面來預(yù)測抗VEGF藥物治療DME對視網(wǎng)膜微循環(huán)的影響[4]。本研究旨在探討康柏西普治療DME對視網(wǎng)膜微循環(huán)的影響。

1對象和方法

1.1對象前瞻性對照研究。收集2019-12/2020-12就診于海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科并診斷為DME的患者14例15眼，其中符合篩選條件的10例11眼納入本研究為DME組，其中男2例，女8例，年齡中位數(shù)為56(42～73)歲，右眼7眼，左眼4眼，治療期間所有DME患者糖化血紅蛋白均控制在10%以內(nèi)[治療前,治療后3、5mo平均糖化血紅蛋白分別為(8.23±0.966)%、(8.04±0.769)%、(7.91±0.511)%]。選取無全身系統(tǒng)疾病和眼底疾病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者15例15眼作為白內(nèi)障組，其中男5例，女10例，年齡中位數(shù)為56(53～62)歲，右眼5眼，左眼10眼。選取年齡性別相匹配的正常視力健康人20例20眼作為對照組，其中年齡中位數(shù)為47(42～49)歲，其中男8例，女12例。DME組與白內(nèi)障組年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.667)；DME組與對照組年齡比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)。糖尿病患者發(fā)生DME年齡都偏大，而年齡較大的健康人群，因其伴有年齡相關(guān)性白內(nèi)障或其他眼部疾病以及全身系統(tǒng)疾病，其最佳矯正視力(BCVA)很難達到1.0，因此我們隨機選取了年齡相對匹配且視力正常的健康人群作為對照組，本研究主要觀測DME患者注射康柏西普后眼部各項指標(biāo)變化，對照組一般資料的差異并不影響研究結(jié)果。DME組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)18歲以上的2型糖尿病患者；(2)經(jīng)熒光素眼底血管造影確診為非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(NPDR)；(3)OCT檢測黃斑中心凹視網(wǎng)膜厚度(CMT)≥250μm。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)除DME外引起視力下降的其他視網(wǎng)膜疾病；(2)前6mo內(nèi)的視網(wǎng)膜治療或內(nèi)眼外科手術(shù)史；(3)眼壓≥25mmHg；(4)屈光不正，近視>6.00D或遠(yuǎn)視>3.00D；(5)嚴(yán)重的屈光介質(zhì)不清和其他需要住院的系統(tǒng)性疾病；(6)未完成6次注射而中途終止的患者。白內(nèi)障組患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)確診為年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者，且需行手術(shù)治療；(2)無任何其他眼部疾病；(3)無高血壓、糖尿病等全身慢性疾病；(4)無手術(shù)史。需收集房水的患者均于術(shù)前告知患者，并簽署相關(guān)知情同意書后，再于術(shù)中收集房水樣本。本研究通過海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2方法

1.2.1一般檢測項目對照組、DME組術(shù)前和術(shù)后隨訪均由我院同一名具有經(jīng)驗的眼科技師行眼科Snellen表視力、非接觸式眼壓、綜合驗光、眼底照相檢查。

1.2.2OCT及OCTA檢查應(yīng)用Cirrus HD OCT 5000光學(xué)相干斷層掃描儀選擇520線×128線黃斑掃描模式，對黃斑中心凹進行掃描，選取B掃描成像清晰的圖片，由軟件自動計算出CMT;選取黃斑區(qū)的6mm×6mm毛細(xì)血管掃描模式，獲取黃斑區(qū)6mm×6mm范圍的毛細(xì)血管圖像。選取內(nèi)界膜至視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層外界作為視網(wǎng)膜淺層進行測量，視網(wǎng)膜淺層毛細(xì)血管中心凹無血管灌注區(qū)(FAZ)面積由同一名眼科醫(yī)師應(yīng)用Cirrus HD 5000 V.10.0 Angio Plex Metrix軟件測量，人工描繪出FAZ邊界，再由軟件自動計算出FAZ面積。視網(wǎng)膜淺層毛細(xì)血管長度密度(VSCP)和視網(wǎng)膜淺層毛細(xì)血管灌注密度(PSCP)均由同一款軟件自動測量，測量范圍為以黃斑中心為中點、6mm×6mm的方形區(qū)域。VSCP為通過描繪血管的線性長度，計算區(qū)域內(nèi)線性長度與區(qū)域面積的比值;PSCP為通過描繪血管直徑寬度，計算血管管徑在區(qū)域內(nèi)的覆蓋面積與區(qū)域面積的比值。

1.2.3房水因子檢測檢測細(xì)胞因子的方法：術(shù)中房水收集在無菌管后立即存放在-80℃的實驗用冰箱中，采用Luminex檢測技術(shù)進行檢測，檢測試劑盒為LXSAHM-09,經(jīng)過樣品稀釋、混勻、吸附和孵育等步驟，所有步驟均嚴(yán)格按照說明書進行操作，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品送微球懸浮陣列技術(shù)(Luminex200TM)檢測儀檢測，自動計算獲得樣品濃度。

1.2.4手術(shù)方法DME組均行每月1次玻璃體腔注射康柏西普眼用注射液共計6次，術(shù)前使用鹽酸左氧氟沙星滴眼液1d，并于當(dāng)日手術(shù)前沖洗結(jié)膜囊。手術(shù)中用鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉患眼并嚴(yán)格按照內(nèi)眼手術(shù)規(guī)范進行消毒鋪巾。在注射康柏西普前,使用1mL注射器針頭于顳側(cè)角膜緣穿刺入前房,抽取房水約0.1mL,撤針后角膜穿刺口自閉。隨后用1mL注射器抽取0.05mL康柏西普于顳上方角膜緣后3.5～4.0mm向玻璃體腔內(nèi)垂直進針注藥，完成注射后迅速拔出針頭,用鑷子夾閉穿刺點防止返流。術(shù)后使用抗生素眼膏涂于結(jié)膜囊內(nèi)，并連續(xù)3d使用左氧氟沙星滴眼液點眼，每天4次。治療后1mo再次注射,共連續(xù)注射6次。白內(nèi)障組患者均于術(shù)中行透明角膜切口前使用1mL注射器針頭抽取房水約0.1mL。所有操作均由同一位經(jīng)驗豐富的眼科醫(yī)師完成。

2結(jié)果

2.1術(shù)前DME組與對照組PSCP、VSCP、FAZ面積的對比DME組術(shù)前PSCP、VSCP較對照組小，F(xiàn)AZ面積較對照組大，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,表1,圖1)。

圖1 DME患者注射康柏西普后黃斑區(qū)視網(wǎng)膜OCTA、OCT圖像 A：術(shù)前；B：注射1mo時；C：注射2mo時；D：注射3mo時；E：注射4mo時；F：注射5mo時。

表1 DME組與對照組術(shù)前BCVA、CMT、VSCP、PSCP、FAZ面積對比

2.2術(shù)前DME組與對照組CMT及BCVA的對比術(shù)前DME組CMT、BCVA值均較對照組高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，表1)。

2.3術(shù)前DME組與白內(nèi)障組相關(guān)房水因子對比DME組術(shù)前房水中IL-6、IL-8、VEGF、ANGPTL4均較白內(nèi)障組高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，表2)。

表2 術(shù)前DME組與白內(nèi)障組相關(guān)房水因子濃度對比 pg/mL

2.4康柏西普治療后DME患者PSCP和VSCP及FAZ面積的變化DME患者注射康柏西普前后不同時間PSCP比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.562，P<0.05，表3)，注射康柏西普前后不同時間VSCP、FAZ比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.376、0.084，均P>0.05)。注射康柏西普2、3、4、5mo時PSCP與基線，注射康柏西普1mo時與注射4、5mo時比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.035、0.004、0.001、0.001、0.026、0.013)，其余時間點兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3，圖2。DME組患者于注射康柏西普1mo時PSCP改善最明顯。與基線相比，注射康柏西普5mo時DME患者黃斑部微循環(huán)缺血改善。

圖2 DME患者注射康柏西普后PSCP、BCVA、CMT的變化 A：PSCP；B:BCVA；C：CMT。

表3 使用康柏西普后DME患者眼部檢查各參數(shù)變化

2.5康柏西普治療后DME患者CMT和BCVA的變化DME患者注射康柏西普前后不同時間CMT、BCVA比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.935、4.357，均P<0.05)。注射康柏西普1、2、3、4、5mo時BCVA與基線比較均有改善(P=0.044、0.004、0.001、0.001、0.001)，其余時間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。注射康柏西普2、3、4、5mo時CMT與基線相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.015、0.006、0.003、0.002)，其余時間點兩兩相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3，圖1、2。注射康柏西普1mo時BCVA提升以及CMT下降最明顯。與基線相比，注射康柏西普5mo時視力明顯提高，CMT顯著下降。

2.6康柏西普治療后DME患者房水因子的變化DME患者使用康柏西普后不同時間房水ANGPTL4、VEGF、IL-6濃度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，不同時間房水中IL-8濃度變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。注射康柏西普3、4、5mo時房水中ANGPTL4的濃度與基線相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.015、0.006、0.003)，其余時間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。注射康柏西普1、2、3、4、5mo時房水中VEGF的濃度與基線，注射康柏西普3、4、5mo時與1mo時相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001、0.001、0.001、0.001、0.001、0.047、0.023、0.015)，其余時間點兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。注射康柏西普1、2、3、4、5mo時房水中IL-6濃度與基線相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.035、0.001、0.001、0.001、0.001)，其余時間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。DME組患者于注射康柏西普1mo時房水中ANGPTL4、VEGF及IL-6濃度下降最明顯，見表4。與基線相比，注射康柏西普5mo時 ANGPTL4、VEGF、IL-6下降。

表4 使用康柏西普后DME患者房水因子濃度變化 pg/mL

2.7康柏西普治療后各參數(shù)變化的相關(guān)性分析DME患者每月注射康柏西普1次連續(xù)6mo后VEGF變化的絕對值與CMT變化的絕對值呈正相關(guān)(rs=0.716，P=0.013)，表明房水中VEGF濃度越降低，CMT越降低，與其余各參數(shù)的變化絕對值均無相關(guān)性(P>0.05)。

3討論

本研究結(jié)果顯示，DME組連續(xù)每月1次注射康柏西普6mo后淺層毛細(xì)血管密度逐漸增加，VSCP略有增加及FAZ面積減小的趨勢，與Zhu等[5]的研究結(jié)果相似，并且DME組患者在第1次注射康柏西普后PSCP改善最明顯，但其改善視網(wǎng)膜缺血的機制尚未明確。既往研究認(rèn)為持續(xù)高血糖狀態(tài)會產(chǎn)生晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)，AGEs可引起血管硬化、激活A(yù)GEs內(nèi)皮受體而增加相關(guān)細(xì)胞因子表達，最終導(dǎo)致毛細(xì)血管收縮、視網(wǎng)膜缺血缺氧。視網(wǎng)膜缺血缺氧狀態(tài)下，機體代償性產(chǎn)生VEGF以恢復(fù)血液供應(yīng)。但玻璃體腔內(nèi)高濃度的VEGF會引起內(nèi)皮細(xì)胞、血-視網(wǎng)膜屏障的破壞，并在血管內(nèi)募集白細(xì)胞增加其對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，導(dǎo)致血管堵塞和灌注減少，最終加重視網(wǎng)膜缺血缺氧。有研究顯示使用抗VEGF藥物可以改善DME患者視網(wǎng)膜血管灌注，其機制可能為抑制VEGF可以減少白細(xì)胞堵塞，使封閉血管再灌注[6-7]。此外，在一項關(guān)于抗VEGF治療腫瘤的研究中，發(fā)現(xiàn)抑制VEGF可以破壞缺乏外周細(xì)胞的血管，將未成熟的血管重塑為更成熟的血管，并且穩(wěn)定基底膜為新生血管再次生長提供框架，該機制可能同樣作用于視網(wǎng)膜內(nèi)[8-9]。

研究顯示ANGPTL4水平與視網(wǎng)膜血流供應(yīng)相關(guān)，其通常表達于缺血性視網(wǎng)膜病中[10]。ANGPTL4與視網(wǎng)膜血流供應(yīng)相關(guān)的原因在于其不僅促進動脈硬化，還促進血管炎癥并增加其通透性，加重視網(wǎng)膜缺血[11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，缺血性視網(wǎng)膜病小鼠模型中，隨著缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)在缺氧視網(wǎng)膜Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的積累，ANGPTL4表達增加，可以作為反映視網(wǎng)膜缺血相關(guān)的生物標(biāo)志物[12]。此外，Kwon等[4]的研究發(fā)現(xiàn)使用抗VEGF藥物可以減少DME患者視網(wǎng)膜血管的丟失，并恢復(fù)無灌注區(qū)血供，通過檢測房水中ANGPTL4的濃度發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4的濃度與視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積成正相關(guān)，并認(rèn)為ANGPTL4可反映視網(wǎng)膜血液供應(yīng)情況。結(jié)合本研究結(jié)果，注射康柏西普后DME患者房水中ANGPTL4濃度下降，并于注射康柏西普1mo時下降最顯著，因此本研究結(jié)果從細(xì)胞因子層面證實注射康柏西普可以改善黃斑部微循環(huán)缺血。

本研究結(jié)果顯示，注射康柏西普后，DME患者BCVA顯著提高，CMT顯著下降，并均于注射康柏西普1mo時改善最顯著，與Zhou等[13]的研究結(jié)果一致。既往研究已證實，VEGF是引起DR患者黃斑水腫的重要因子，其作用機制是高濃度的VEGF破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞及血-視網(wǎng)膜屏障，引起黃斑水腫[1]。康柏西普是我國自主研發(fā)的新型抗VEGF藥物，它是一種重組融合蛋白，含有VEGF受體1(VEGFR1)的第二個免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域和VEGFR2的第三和第四Ig結(jié)構(gòu)域和人IgG的Fc區(qū)，它可以與VEGF-A、VEGF-B和胎盤生長因子(PlGF)的所有同工型結(jié)合。理論上它對VEGF的親和力較單抗類藥物更強[14]。Liu等[15]關(guān)于康柏西普與雷珠單抗治療DME患者療效的研究發(fā)現(xiàn)，兩者對BCVA都有提升作用，但康柏西普減輕黃斑水腫的效果優(yōu)于雷珠單抗。可能的原因在于：融合蛋白類的康柏西普，其在玻璃體腔內(nèi)的半衰期為4.2d，較雷珠單抗的2.88d半衰期更長，并且其針對的靶點較單抗類藥物更多。

本研究結(jié)果顯示，隨著注射康柏西普時間的延長，DME患者房水中的VEGF、IL-6都顯著下降，與Xia等[16]的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)使用康柏西普可以顯著減輕DR患者視網(wǎng)膜病變程度，以及顯著降低IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子水平，證明康柏西普對這些炎癥因子有抑制作用。其原因可能是DME發(fā)展過程中VEGF和炎癥因子作用途徑大量重疊，VEGF可刺激促炎基因的表達，并允許白細(xì)胞滲透到視網(wǎng)膜中[17]。值得注意的是注射康柏西普1mo時，DME患者房水中VEGF、IL-6濃度下降十分顯著，與Zhang等[18]的研究結(jié)果相似，其研究發(fā)現(xiàn)注射康柏西普1wk后患者房水中VEGF濃度開始顯著下降，反映康柏西普對VEGF有十分強的抑制作用。理論上VEGF作為一種促炎介質(zhì)，抗VEGF治療可以抑制眼內(nèi)炎癥因子水平。

此外，分析本研究中VEGF與CMT變化的絕對值發(fā)現(xiàn)，VEGF濃度與CMT呈正相關(guān)，與Mastropasqua等[6]的研究結(jié)果一致。側(cè)面證實了VEGF在DME的發(fā)展過程中至關(guān)重要的作用。

本研究選擇淺層毛細(xì)血管的變化反映黃斑區(qū)視網(wǎng)膜血液供應(yīng)的原因：(1)HD-OCT獲取的淺層毛細(xì)血管密度清晰度最佳；(2)深層毛細(xì)血管的末端會被腫脹的視網(wǎng)膜遮擋而影響毛細(xì)血管密度的測算[19]。本研究運用PSCP、VSCP進行分析，來反映視網(wǎng)膜毛細(xì)血管變化。視網(wǎng)膜的血液供應(yīng)與毛細(xì)血管的管徑大小、血液的流動速度以及血液的氧含量有關(guān)，而在評價血液供應(yīng)方面PSCP優(yōu)于VSCP。

本研究從細(xì)胞因子層面證實了使用康柏西普治療DME可以改善黃斑區(qū)缺血。同時本研究沒有發(fā)現(xiàn)使用康柏西普治療后加重視網(wǎng)膜缺血等情況,說明使用康柏西普治療從安全角度考慮是可行的。此外，使用康柏西普治療DME能有效提升BCVA及減輕黃斑水腫。但本研究也存在隨訪時間短、樣本量小，對遠(yuǎn)期效果未能觀察等不足，在后續(xù)研究中還需進行更多關(guān)于康柏西普治療DME相關(guān)的細(xì)胞因子及其作用途徑的研究才能解釋其如何改善視網(wǎng)膜缺血。