敲除EZH2抑制人宮頸癌細胞系遷移和侵襲

陳 茜，劉 憲，崔 南，翟 陽

(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院 生殖醫(yī)學科，陜西 西安 710061; 2.陜西省腫瘤醫(yī)院 腫瘤內科，陜西 西安 710061)

在發(fā)展中國家，宮頸癌(cervical cancer)是女性第二大高發(fā)和第三大致死性癌[1]。其發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢，嚴重威脅女性健康。隨著腫瘤的基因治療逐漸成為研究熱點，探尋與宮頸癌相關的原癌基因并為診斷和治療宮頸癌提供新的研究方向至關重要。

EZH2(enhancer of zeste homolog 2)位于人染色體7q35 位點, 參與細胞周期、分化和凋亡等多種生理或病理過程[2-3]。在腫瘤細胞和腫瘤干細胞EZH2的高表達或者突變可以誘發(fā)肝癌、乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌、子宮內膜癌等腫瘤的發(fā)生和演變[4]，靶向EZH2有望成為癌治療的新策略，目前關于EZH2在宮頸癌中的研究較少。本研究通過檢測宮頸癌組織和細胞中EZH2的表達，探討敲除其表達對宮頸癌細胞遷移和侵襲的影響及作用機制，以期為宮頸癌的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床組織標本的采集與細胞系：本研究所用的正常宮頸組織、宮頸鱗狀細胞癌組織標本取自西安交通大學第一附屬醫(yī)院2009年12月至2014年3月間婦產科住院患者，年齡29～73歲，平均年齡48歲，其中正常宮頸40例，宮頸鱗狀細胞癌62例。正常宮頸組織來源于子宮肌瘤子宮全切患者。侵襲型宮頸鱗狀細胞癌患者術前均未接受放射治療、化學治療或免疫治療，住院后行廣泛全子宮及雙側附件切除+盆腔淋巴結清掃術，術后病理確診。所有收集標本組織切成1 cm×1 cm×1 cm組織方塊，用蠟塊包埋后行連續(xù)切片，厚度4 μm左右，載玻片行多聚L-賴氨酸處理。本研究已獲得西安交通大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準[2016倫審科學第(117)號]及受試者簽署的知情同意書。人宮頸癌HeLa、人子宮頸鱗癌SiHa細胞系(ATCC細胞庫)。

1.1.2 主要試劑:DMEM高糖培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific公司)，胎牛血清(Hyclone公司)；青霉素、鏈霉素(Sigma-Aldrich公司)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)，EZH2-knockout質粒及其control 質粒(美國麻省理工學院科學家張鋒實驗室)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理:復蘇HeLa和SiHa細胞后，用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)增殖期的HeLa和SiHa細胞進行轉染。分別取對數(shù)增殖期的HeLa和SiHa細胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)細胞達70%～80%匯合時，按Lipofectamine2000 轉染試劑說明書提供的方法分別將EZH2-knockout質粒及其control質粒轉染到HeLa和SiHa細胞中[5]。

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達:從細胞中提取蛋白。經BCA 蛋白定量法測定蛋白質濃度。蛋白經10% SDS-PAGE，應用Bio-Rad濕轉法轉移到PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入5%脫脂牛奶稀釋的一抗(1∶1 000稀釋的兔抗人EZH2、鼠抗人STAT3、兔抗人p-STAT3和鼠抗人GAPDH抗體)在4 ℃孵育過夜，與相應的1∶10 000稀釋的二抗在室溫孵育1 h，加ECL發(fā)光劑，用Western blot化學發(fā)光成像系統(tǒng)一體機進行曝光，采用ImageJ2×軟件進行吸光度(A)值分析。

1.2.3 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移:將EZH2-knockout及對照的HeLa和SiHa細胞種于35 mm培養(yǎng)皿中，24 h后用滅菌的20 μL量程的小槍頭尖端進行劃痕，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗多次，加入無血清的普通DMEM高糖培養(yǎng)液后拍照(0 h)，并顯微鏡下記錄拍照位置。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24 h取出后拍照。實驗重復3次。采用ImageJ2×軟件進行結果分析。

1.2.4 Transwell小室法檢測細胞體外遷移和侵襲:將基質膠(Matrigel)4 ℃過夜融化，用無血清DMEM高糖培養(yǎng)液以1∶8濃度稀釋，每個侵襲小室加100 μL稀釋后的Matrigel(細胞遷移實驗不包括此步)，小室放入24孔板中，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，使Matrigel形成凝膠狀。之后在Transwell 小室的上下室均加入500 μL無血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中30 min，取處于對數(shù)增殖期的EZH2-knockout和對照細胞，用無血清DMEM培養(yǎng)基調整細胞為2×105個/mL，侵襲小室上室加400 μL細胞懸液，侵襲小室下室加1 mL含10% FBS 的DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24及48 h后，取出小室用75%乙醇溶液固定后用0.1%結晶紫溶液染色20 min，PBS洗滌后將小室底面朝上，自然晾干，置于顯微鏡下觀察并拍照，上下左右隨機選取4個視野拍照并計數(shù)穿過聚碳酸脂膜的細胞數(shù)，實驗重復3次。采用ImageJ2×軟件進行結果分析。

1.2.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞中STAT3的表達:Trizol法提取細胞中的總RNA，進行反轉錄，反轉錄條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃，以反轉錄產物為模板進行實時熒光定量PCR，GAPDH為內參。引物序列：GAPDH-F：5′-GCACCGTCAAGG CTGAGAAC-3′,GAPDH-R：5′-TGGTGAAGACGCCAGT GGA-3′；STAT3-F：5′-CACCAAGCGAGGACTGAGCAT C-3′,STAT3-R：5′-AGCCAGACCCAGAAGGAGAAGC-3′。按照SYBR?Premix Ex TaqTM說明書進行，反應條件為第1步(1個循環(huán))95 ℃ 30 s；第2步(40個循環(huán))95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，第3步溶解(1個循環(huán))。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 EZH2 在宮頸癌組織中高表達

在正常宮頸組織和宮頸鱗狀細胞癌EZH2表達的陽性率分別為12.5%和74.2%(P<0.05)。EZH2在宮頸鱗狀細胞癌的評分高于正常宮頸組織(P<0.05)。

EZH2蛋白在5個宮頸癌細胞系均有不同程度的表達，遂應用CRISPR/Cas9技術敲除宮頸癌細胞HeLa和SiHa細胞中EZH2的表達，通過細胞測序和Western blot鑒定[5]。

2.2 敲除EZH2抑制宮頸癌細胞的遷移能力

敲除EZH2后劃痕愈合速度顯著慢于對照組,其中敲除EZH2組HeLa和SiHa細胞的劃痕愈合率24與48 h均低于對照組(P<0.05，圖1A,B)。

A,B.effect of EZH2 knockout on the migration of HeLa and SiHa cells was detected by cell scratch assay; *P<0.05 compared with CRISPR-Ctrl

2.3 敲除EZH2抑制宮頸癌細胞的Transwell體外遷移能力

敲除EZH2后Transwell 小室遷移穿膜細胞數(shù)目顯著少于對照組,其中敲除EZH2組HeLa和SiHa細胞的Transwell 小室遷移穿膜細胞數(shù)目均低于對照組(P<0.05)(圖2A,B)。

A，B: Transwell migration assay was used to detect the effect of EZH2 knockout on the migration of HeLa and SiHa cells(×40，scale bar=50 μm); *P<0.05 compared with CRISPR-Ctrl

2.4 敲除EZH2抑制宮頸癌細胞的Transwell體外侵襲能力

敲除EZH2后Transwell 小室侵襲穿膜細胞數(shù)目顯著少于對照組,其中敲除EZH2組HeLa和SiHa細胞的Transwell 小室侵襲穿膜細胞數(shù)目均低于對照組(P<0.05)(圖3A,B)。

A,B.Transwell invasion assay was used to detect the effect of EZH2 knockout on the invasion of HeLa and SiHa cells(×40，scale bar=50 μm); *P<0.05 compared with CRISPR-Ctrl

2.5 敲除EZH2可能通過STAT3信號通路抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲

敲除EZH2組HeLa和SiHa細胞STAT3的mRNA表達水平與對照組相比沒有差異(圖4A)。在HeLa和SiHa細胞中，與對照組相比，敲除EZH2后p-STAT3 蛋白水平明顯降低(P<0.05)，而STAT3總蛋白表達沒有變化(圖4B,C)。

A.expression of STAT3 mRNA in EZH2 knockout group and control group was detected by RT-qPCR; B，C.Western blot was used to detect the protein levels of STAT3 and p-STAT3;*P<0.05 compared with CRISPR-Ctrl

3 討論

宮頸癌是發(fā)生于子宮頸部位的惡性腫瘤，近年來宮頸癌的發(fā)病趨于年輕化，其預后往往較差，嚴重威脅著女性的生命健康。目前中晚期宮頸癌5年生存率仍無明顯的提高，患者的生存質量也沒有得到明顯改善。這就要求進一步去研究宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展機制，推進宮頸癌的預防、診斷及分子治療的發(fā)展和改進[6]。

研究發(fā)現(xiàn)EZH2在多種腫瘤中均呈高表達，被認為是一個新的候選癌基因，且其高表達與腫瘤的惡性程度和不良預后均有顯著相關性，因此抑制EZH2 的表達可減緩腫瘤的生長[7]。表明EZH2 在研究腫瘤發(fā)病機制和治療等方面具有較高的潛在價值。前期研究發(fā)現(xiàn)，EZH2在宮頸癌組織中高表達，并應用CRISPR/Cas9技術在HeLa和SiHa細胞中敲除EZH2，作為后續(xù)研究工具細胞。

在非小細胞肺癌EZH2的高表達促使其侵襲及遷移能力增強[8]。在三陰性乳腺癌，EZH2可以通過轉錄抑制TIMP2，從而提高MMP-2 and MMP-9的活性來促進乳腺癌細胞的侵襲和轉移[9]。抑制EZH2 的表達能降低前列腺癌細胞的增殖和侵襲[10]。本研究結果表明，抑制EZH2的表達能抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲。STAT3是STAT轉錄因子家族的一員，參與調控細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生和侵襲轉移等病理生理過程[11]，STAT3信號通路被證實與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[12-13]。在膀胱癌，EZH2水平與腫瘤組織學分期和分級相關，其表達水平越高，侵襲性越強，腫瘤分期越晚，相應預后越差，并通過JAK2/STAT3信號通路控制膀胱癌細胞的增值、侵襲與轉移[14]。在膠質母細胞瘤磷酸化的EZH2通過甲基化STAT3增加p-STAT3的表達，進而導致STAT3信號通路活性增強，侵襲性增強[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在HeLa細胞和SiHa細胞中抑制EZH2的表達，會導致p-STAT3表達量下降，并導致STAT3信號通路活性減低。

總的來說，本研究結果證實EZH2影響了HeLa和SiHa細胞的遷移和侵襲，參與調控宮頸癌細胞的細胞功能，同時顯示其發(fā)揮作用可能與STAT3信號通路有關。這為今后研究宮頸癌的發(fā)病原因提供了實驗基礎，提示EZH2可作為臨床治療宮頸癌的分子靶點，或聯(lián)合其他藥物進行特異性靶向治療，為宮頸癌的治療開辟了新思路。但EZH2 在宮頸癌細胞遷移和侵襲作用中的活化狀態(tài)下STAT3如何調節(jié)下游靶基因的中間環(huán)節(jié)具體機制，以及侵襲的體內實驗均還有待于進一步研究。