鉤吻堿通過下調circ_001680抑制類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖和侵襲

劉新兵，張美紅

(棗莊市中醫醫院 1.風濕病科；2.急診科，山東 棗莊 277000)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以炎性滑膜炎為主的慢性自身免疫性疾病，嚴重影響患者生存質量。近年來研究顯示，類風濕關節炎滑膜成纖維細胞(rheumatoid orthritis synovial fibroblasts，RASFs)的異常增殖和侵襲促進RA的發生發展[1]，抑制其增殖和侵襲對RA的治療尤為重要。鉤吻堿(gelsemium)是馬錢科胡蔓藤屬植物鉤吻的主要成分之一，具有多種藥理活性。研究顯示，鉤吻堿可能通過抑制JAK2/STAT3/survivin通路的降低人舌癌細胞株Tca8113的增殖能力，并促進細胞凋亡，發揮抗舌癌作用[2]；鉤吻堿可抑制人結腸癌細胞和人臍靜脈內皮細胞增殖，并降低人臍靜脈內皮細胞的遷移、侵襲及血管生成能力[3]。但目前，鉤吻堿能否影響RASFs增殖、遷移和侵襲還未見報道。

環狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類呈閉合環狀結構的非編碼RNA，參與調控細胞增殖、分化和凋亡等生命活動，在RA的發生發展中起重要作用[4]。Circ_001680屬于circRNA家族成員，其在胃癌[5]和結直腸癌[6]中表達升高，促進腫瘤細胞增殖和轉移。但目前，circ_001680對RASFs增殖、遷移和侵襲的影響還未知。本研究通過體外分離培養RASFs，主要觀察了鉤吻堿和干擾circ_001680對RASFs增殖、遷移和侵襲的影響及鉤吻堿能否靶向調控circ_001680發揮作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

鉤吻堿(gelsemine)，純度>98 %(成都瑞芬思德丹生物科技有限公司)；DMEM培養基、細胞計數試劑盒-8(CCK-8)和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；胎牛血清(FBS)(浙江天杭生物科技股份有限公司)；LipofectamineTM2000試劑盒(Invitrogen公司)；Circ_001680小干擾RNA(si-circ_001680)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、circ_001680過表達載體(si-circ_001680)、空載體(si-NC)和PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)；兔抗人上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經鈣黏附素(N-cadherin)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(Santa Cruz公司)；RNA抽屜試劑盒、反轉錄試劑盒和PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 RASFs的體外分離培養和轉染：滑膜組織取自2018年10月至2019年5月于棗莊市中醫醫院確診的RA患者，組織取材經本院醫學倫理委員會批準(批準號：20180815)，患者知情同意。將手術過程中去除的病變滑膜組織迅速置于預冷的Hank’s平衡鹽溶液中，參照文獻[7]方法分離培養RASFs：清洗滑膜組織，除去肪組織和骨組織。加5 mL高糖DMEM培養基，手術剪剪碎，用II型膠原酶37 ℃消化6 h，再用50.25 %胰蛋白酶消化細胞1 h。經細胞篩網(70 μm孔徑)過濾后，將濾液離心(1 500 r/min、5 min)，棄上清。加含10 % FBS的DMEM培養基，于培養箱中分瓶培養。當細胞匯合度至80 %時，換液傳代，用第3～6代細胞進行后續實驗。

1.2.2 細胞轉染和分組處理：將對數期RASFs以1.0×105個/孔接種于6孔板中，用LipofectamineTM2000脂質體法，分別轉染si-NC、si-circ_001680、pcDNA、pcDNA-circ_001680，轉染12 h后，更換培養基。再培養24 h，RT-qPCR檢測細胞中circ_001680表達驗證轉染效果。未轉染的RASFs分為對照組(用常規培養基培養)和低、中、高濃度gelsemine組(gelsemine-L組、gelsemine-M組和gelsemine-H組，分別用含50、100、200 μg/mL[8]gelsemine的培養基培養)。轉染si-NC、si-circ_001680的RASFs用常規培養基培養，記為si-NC組、si-circ_001680組。轉染pcDNA、pcDNA-circ_00168的RASFs均用含200 μg/mL gelsemine的培養基培養，記為gelsemine+pcDNA組、gelsemine+pcDNA-circ_001680組。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖：將RASFs均以2.5×104個/孔接種于96孔板中，培養4 h后，棄培養基。分組培養24 h后，加10 μL CCK-8。于培養箱中孵育2 h后，使用酶標儀檢測吸光度(A)值，檢測波長為450 nm。

1.2.4 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力：將RASFs均以5.0×104個/孔接種于6孔板中，培養 4 h后，棄培養基。分組培養，每2 d換液1次，培養14 d后，棄培養基。經多聚甲醛固定、結晶紫染色后，顯微鏡觀察，對超過50個細胞的克隆進行計數。

1.2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力：將未轉染、轉染后的RASFs均以1.0×105個/孔接種于6孔板中，培養4 h后，棄培養基。用200 μL移液器槍頭沿中軸線劃兩條平行線，磷酸鹽緩沖液清洗除去劃痕間細胞，并測量劃痕間寬度，記為(d)0 h。分組培養24 h后，再次測量劃痕間寬度，記為(d)24 h。

1.2.6 Transwell小室法檢測細胞侵襲：將Transwell小室置于24孔板中，在上室中鋪Matrigel基質膠，自然晾干后，加含1.0×104個細胞的細胞懸液，下室加500 μL培養基。培養4 h后，棄培養基。分組培養24 h后，棄培養基。經多聚甲醛固定、結晶紫染色后，顯微鏡觀察。隨機取5個視野，統計侵襲細胞數。

1.2.7 蛋白印跡法檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白表達：將RASFs均以1.0×105個/孔接種于6孔板中，培養4 h后，棄培養基。分組培養24 h后，RIPA試劑提取細胞中總蛋白。經BCA法定量、12% SDS-PAGE、轉膜及5 %脫脂奶粉中封閉2 h后，分別于E-cadherin(1∶500)、N-cadherin(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)一抗孵育液中進行孵育，4 ℃孵育過夜。再于山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育液中，37 ℃孵育1 h。加顯影液避光顯影，凝膠系統曝光拍照，Image J軟件分析E-cadherin、N-cadherin相對于GAPDH的表達水平。

1.2.8 RT-qPCR檢測circ_001680表達：將RASFs均以1.0×105個/孔接種于6孔板中，培養4 h后，棄培養基。分組培養24 h后，用RNA抽屜試劑提取總RNA。經反轉錄后，行PCR擴增。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環。引物序列：circ_001680上游5′-GCTCA CACCAATCCCCTG-3′，下游5′-GCCTGGCACACAG TAGACAC-3′；GAPDH上游5′-GATATTGTTGCCAT CAATGAC-3′，下游5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′。2-△△Ct法計算circ_001680相對于內參GAPDH的表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 鉤吻堿對RASFs增殖的影響

與對照組比較，鉤吻堿呈濃度依賴性降低RASFs的A值和克隆形成數(P<0.05)(表1)。

表1 鉤吻堿對RASFs增殖的影響

2.2 鉤吻堿對RASFs遷移和侵襲的影響

與對照組比較，鉤吻堿呈濃度依賴性降低RASFs劃痕愈合率和侵襲細胞數及細胞中N-cadherin蛋白表達(P<0.05)，而促進E-cadherin蛋白表達(P<0.05)(圖1，表2)。

表2 鉤吻堿對RASFs遷移和侵襲及蛋白表達的影響

A.effect of gelsemine on the protein expression of E-cadherin and N-cadherin in RASFs; B.effect of gelsemine on the migration of RASFs; C.effect of gelsemine on the invasion of RASFs

2.3 鉤吻堿對RASFs中circ_001680表達的影響

與對照組比較，鉤吻堿呈濃度依賴性降低RASFs中circ_001680表達(P<0.05)(表3)。

表3 鉤吻堿對RASFs中circ_001680表達的影響

2.4 干擾circ_001680表達對RASFs增殖的影響

與si-NC組比較，si-circ_001680組RASFs中circ_001680表達降低(P<0.05)，RASFs的A值和克隆形成數降低(P<0.05)(表4)。

表4 干擾circ_001680表達對RASFs增殖的影響

2.5 干擾circ_001680表達對RASFs遷移和侵襲的影響

與si-NC組比較，circ_001680組RASFs劃痕愈合率和侵襲數及細胞中N-cadherin蛋白表達降低(P<0.05)，而E-cadherin蛋白表達升高(P<0.05)(圖2，表5)。

表5 干擾circ_001680對RASFs遷移、侵襲及蛋白表達的影響

A.protein expression of E-cadherin and N-cadherin in RASFs after interference with circ_001680; B.migration of RASFs after interference with circ_001680; C.invasion of RASFs after interference with circ_001680

2.6 過表達circ_001680減輕鉤吻堿對RASFs增殖、遷移和侵襲及蛋白表達的作用

轉染pcDNA-circ_001680的RASFs中circ_001680表達明顯高于轉染pcDNA的細胞(3.27±0.28比1.00±0.00，P<0.05)；與gelsemine+pcDNA組比較，gelsemine+pcDNA-circ_001680組RASFs的A值、克隆形成數、劃痕愈合率和侵襲數及細胞中N-cadherin蛋白表達升高(P<0.05)，而E-cadherin蛋白表達降低(P<0.05)(圖3，表6)。

A.protein expression of E-cadherin and N-cadherin in RASFs over-expressing circ_001680 treated with gelsemine; B.migration of RASFs over-expressing circ_001680 treated with gelsemine; C.invasive over-expressing circ_001680 treated with gelsemine

表6 過表達circ_001680減輕鉤吻堿對RASFs增殖、侵襲及蛋白表達的作用

3 討論

目前，RA缺乏有效的治療藥物。近年來，從天然植物中提取的活性成分生物堿因作用靶點多、效果明顯和副作用小等優點，在疾病的治療中發揮重要作用。研究顯示，烏頭堿可呈劑量依賴性抑制RASFs增殖，并誘導RASFs凋亡[9]；青藤堿可通過抑制RANK和NF-κB的活化減輕脂多糖誘導的人成纖維樣滑膜細胞炎性反應，并阻礙細胞增殖，促進細胞凋亡[10]。有報道稱，鉤吻堿可顯著抑制人臍靜脈內皮細胞增殖和遷移，并促進細胞凋亡[8]，但其對RASFs惡性生物學行為的影響還未見相關報道。

本研究主要探討了鉤吻堿對RASFs增殖、遷移和侵襲的影響，結果顯示，鉤吻堿可呈劑量依賴性降低RASFs的A值和克隆形成數，提示其可抑制RASFs增殖。與腫瘤細胞相似，RASFs具有侵襲性，抑制其對關節軟骨的侵襲，可減輕骨關節破壞[11]。本研究顯示，鉤吻堿降低RASFs劃痕愈合率和侵襲數，說明其可阻礙RASFs遷移和侵襲。上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchimal transition, EMT)是細胞失去上皮極性而獲得間質細胞特性的過程，主要表現為上皮標志物如E-cadherin表達降低，而間質標志物如N-cadherin表達升高[12]。細胞在經過EMT過程后，細胞間黏附作用降低，細胞骨架發生重組，最終導致其更易向周圍組織遷移和侵襲[13]。本研究顯示，鉤吻堿抑制RASFs中N-cadherin蛋白表達，而提高了E-cadherin蛋白表達，且呈濃度依賴性，提示其可能通過抑制EMT過程來阻礙RASFs遷移和侵襲。

CircRNA在真核生物中廣泛存在，參與心血管疾病在內的多種疾病的發展進程[14]。研究已表明，多種circRNA參與RA的發生發展。例如，RASFs中circ_0088036表達升高，其可靶向miR-140-3p/SIRT 1軸促進RASFs增殖和遷移，進而促進RA的發展進程[15]。本研究顯示，干擾circ_001680表達對RASFs的增殖、遷移和侵襲起抑制作用，提示其有可能作為RA治療的分子靶點。本研究還顯示，鉤吻堿可呈濃度依賴性抑制RASFs中circ_001680的表達，而過表達circ_001680減輕其對RASFs增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示其可能通過下調circ_001680來抑制RASFs增殖、遷移和侵襲。

綜上，鉤吻堿可抑制RASFs增殖、遷移和侵襲，其作用機制可能與下調circ_001680表達有關，有可能成為治療RA的藥物。