LRCH1維持狼瘡腎炎模型小鼠調節性T細胞的功能

覃智慧，譚德敏，王旺珍，張 瑤

(湖北民族大學附屬民大醫院 腎病內科, 湖北 恩施 445000)

狼瘡腎炎(lupus nephritis)就是系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)腎損傷的臨床表現，是機體的自身抗體形成免疫復合物后所引發的腎臟炎性反應[1]。調節性T細胞(regulatory T cells, Tregs)是維持免疫耐受和自身免疫平衡的關鍵細胞，通過抑制自身免疫中的T細胞活化可防止自身免疫病的發生[2]。在MRL/lpr SLE模型小鼠中Tregs功能活躍[3]，上調Tregs的功能可以減輕狼瘡腎炎的進展[4]，但SLE過程中影響Tregs功能的機制尚未完全明確。本研究在MRL/lpr狼瘡腎炎模型小鼠中研究富含亮氨酸的重復序列和鈣調理蛋白同源域1(leucine rich repeats and calponin homology domain containing 1，LRCH1)在Tregs內的表達和功能，從而揭示狼瘡腎炎的進展機制。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:SPF級SLE模型小鼠MRL/lpr(6月齡)和C57BL/6(6月齡)小鼠(南京大學模式動物實驗平臺)，綠色熒光蛋白(GFP)轉基因小鼠(C57BL/6背景)(賽業生物模式動物中心)。

1.1.2 試劑及試劑盒:Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)和紅細胞裂解液和RIPA裂解液(Thermo Fisher Scientifical公司)；RPMI1640培養基(Gibco公司)；膠原酶 D(Roche Diagnostics公司)；DNA酶Ⅳ(Sigma-Aldrich公司)；流式抗體：FITC-CD45、APC/Cy7-CD、APC-CD25、PE-CD127和FOXP3 Fix/Perm Buffer Set(Biolegend公司)；Trizol(上海閃晶分子生物科技有限公司)；BeyoRTTMcDNA試劑盒和BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix(上海碧云天生物技術公司)；EasySepTM小鼠CD4+CD25+調節性T 細胞分選試劑盒Ⅱ(Stemcell Technologies公司)；抗p-STAT5和STAT5抗體(Cell Signaling Technology公司)；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(Biolegend公司)；白細胞介素2(Interleukin-2，IL-2，上海滬震生物科技公司)；抗CD3抗體和CD28抗體(eBioscience公司)；羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE，北京諾為生物技術公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備單細胞懸液:斷椎處死小鼠后，40 mL冰預冷的HBSS 從心尖灌注小鼠。研磨脾臟至單個細胞懸液。1 mL紅細胞裂解液重懸細胞3 min。離心洗滌后用冰預冷的0.02%自制磷酸鹽緩沖液重懸細胞。去除腎臟包膜，剪成約1 mm×1 mm×1 mm組織塊，用3 mL含1 600 kU/mL 膠原酶 D 和濃度為0.2 g/L DNA酶 Ⅳ 的RPMI1640培養基于37 ℃ 孵育30 min后，按照脾臟單細胞懸液的制備方法進行處理。

1.2.2 流式細胞測量術檢測L細胞表面標志染色：200 μL PBS重懸1×106個細胞，一抗冰上孵育30 min，洗滌重懸后行流式細胞儀檢測。抗體均為2 μg/mL。Foxp3染色：FOXP3 Fix/Perm Buffer Set說明書進行固定、破膜、染色和檢測。

1.2.3 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測:用Trizol提取細胞RNA。用BeyoRTTMcDNA試劑盒合成cDNA。cDNA與BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix混合后放入7500熒光定量PCR儀50 ℃加熱2 min，95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火15 s，75 ℃延申15 s，40個循環。2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.4 過繼輸注:制備GFP轉基因小鼠脾臟單細胞懸液，用EasySepTM調節性T 細胞分選試劑盒Ⅱ分選CD4+CD25+T細胞。將2×106CD4+CD25+T細胞重懸于100 μL PBS，經眼球后靜脈注射到C57BL/6小鼠或MRL/lpr小鼠體內。對照組輸注PBS。1周后處死受者小鼠進行檢測。

1.2.5 免疫印跡(Western blot)檢測蛋白:RIPA裂解液冰上裂解細胞30 min提取蛋白。常規電泳、轉膜和封閉后與一抗(1∶1 000)4 ℃反應過夜。二抗(1∶2 000)孵育1 h。ODYSSE紅外成像儀掃膜，測定條帶吸光度值并計算相對表達量。

1.2.6 CD4+CD25+T細胞培養 按上述方法分選C57BL/6小鼠的CD4+CD25+T細胞，流式細胞測量術驗證細胞純度為92.44%。Tregs的培養和siRNA轉染按照文獻方法[5]。轉染48 h后進行檢測。LRCH1 siRNA(正向引物:5′-CAGCUAGUGAUACUU CCUAUCAUGT-3′；反向引物：5′-ACAUGAUAGGAA GUAUCACUAGCUGCC-3′)和陰性對照siRNA(可參1.1.2)。為檢測IL-2信號途徑的活化，轉染48 h后加入500 μL RPMI1640培養基孵育6 h，加入100 U/mL IL-2處理細胞10～20 min。

1.2.7 流式細胞測量術檢測CD4+CD25-T細胞的增殖 從6月齡的MRL/lpr小鼠與C57BL/6小鼠收集脾臟和腎臟內的單個核細胞，依次識別淋巴細胞和CD45+CD4+T細胞，繼而識別并分選CD45+CD4+CD25+CD127lowT細胞(圖1A)。

96孔板(Corning)用5 μg/mL CD3抗體4 ℃包被過夜。用調節性T細胞分選試劑盒Ⅱ陰性分選C57BL/6小鼠脾臟CD4+CD25-T細胞并用5 μmol/L MCFSE進行標記。用含4 μg/mL CD28抗體和200 U/mL IL-2的RPMI1640培養基調節細胞為1×106/mL，接種至96孔板，每孔100 μL。4 h后每孔加入1×105Tregs，共同培養72 h后用流式細胞術測量檢測。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 MRL/lpr小鼠腎臟Tregs高表達LRCH1

與C57BL/6小鼠的CD45+CD4+T細胞相比，兩種小鼠的脾臟和腎臟CD45+CD4+CD25+CD127lowT細胞均高表達Foxp3(圖1B)，確定該群細胞為Tregs。與其他組細胞相比，MRL/lpr小鼠腎臟Tregs高表達LRCH1 mRNA(圖1C)。

A:gating and sorting of CD45+CD4+CD25+CD127low T cells from mouse spleens and kidneys, B6-S.C57BL/6 mouse spleen, B6-K.C57BL/6 mouse kidney, Lpr-S.MRL/Lpr mouse spleen, Lpr-K.MRL/Lpr mouse kidney; B:Foxp3 mRNA levels in sorted CD45+CD4+CD25+CD127low T, the mouse splenic CD4+ T cells(B6-CD4)were used as control,*P<0.01 compared with B6-CD4 group; C:LRCH1 mRNA levels in sorted CD45+CD4+CD25+CD127low T cells, 2m.2-month-old mice, 6m.6-month-old mice, *P<0.01 compared with B6-S group

2.2 MRL/lpr小鼠腎臟局部環境誘導LRCH1在Tregs 的表達

檢測受者小鼠脾臟和腎臟內過繼輸注的外源性GFP+Tregs(圖2A)，只有MRL/lpr小鼠腎臟GFP+細胞中LRCH1的表達上調(圖2B)。與野生型小鼠GFP+細胞相比，MRL/lpr小鼠脾臟和腎臟內的GFP+細胞IL-10上調(interleukin-10，IL-10)、TGF-β(transforming growth factor beta，TGF-β)(圖3A)和CD25表達均上調(圖3B)。

A:gating and sorting of GFP+ cells from mouse spleens and kidneys, B6.C57BL/6 mice, Lpr.MRL/Lpr mice;B:LRCH1 mRNA levels in sorted GFP+ cells, B6-S.spleens of recipient C57BL/6 mice, B6-K.kidneys of recipient C57BL/6 mice, Lpr-S.spleens of recipient MRL/Lpr mice, Lpr-K.kidneys of recipient MRL/Lpr mice; *P<0.05 compared with B6-S group

A.mRNA levels of IL-10 and TGF-β in GFP+ cells(n=8); B.expression of CD127 and CD25 on the surface of GFP+ cells; *P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001 compared with B6-S group

2.3 LRCH1維持Tregs的免疫抑制功能

轉染LRCH1 siRNA的CD4+CD25+Tregs，LRCH1的表達降低(圖4A)。在無IL-2的培養環境中，Tregs的Foxp3表達顯著下降，而IL-2可有效維持Foxp3的表達(圖4B,C)。Lrch1敲低后即使IL-2存在，Foxp3的表達也顯著降低(圖4B,C)。Lrch1敲低的Tregs不能有效抑制CD4+CD25-T細胞的增殖，表現為CD4+CD25-T細胞的CFSE熒光顯著降低(圖4D)。

A:LRCH1 mRNA levels in Tregs 48 hours after siRNA transfection, No siRNA.Tregs treated with Lipofectamine 2000 only, C-siRNA.Tregs transfected with scramble control siRNA, L-siRNA.Tregs transfected with LRCH1 siRNA(n=6);B.representative plots showing Foxp3 staining in transfected Tregs, Fresh.freshly sorted Tregs, C-siRNA PBS.Tregs transfected with scramble control siRNA were treated with PBS, L-siRNA PBS.Tregs transfected with LRCH1 siRNA were treated with PBS, C-siRNA IL-2.Tregs transfected with scramble control siRNA were treated with IL-2, L-siRNA IL-2.Tregs transfected with LRCH1 siRNA were treated with IL-2; C.statistical analysis of the fluorescence intensity of Foxp3 in Tregs(n=8); D.proliferation of CD4+CD25-T cells, Left panel.histograms of CFSE intensities in CD4+CD25-T cells, Right panel.statistical analysis of CFSE intensities, No activation.CFSE-labeled CD4+CD25-T cells without activation, C-siRNA activation.CFSE-labeled CD4+CD25-T cells activated by CD3 antibody and CD28 antibody in the presence of Tregs transfected with scramble control siRNA, L-siRNA activation.CFSE-labeled CD4+CD25-T cells activated by CD3 antibody and CD28 antibody in the presence of Tregs transfected with LRCH1 siRNA, No Treg activation.CFSE-labeled CD4+CD25-T cells activated by CD3 antibody and CD28 antibody in the absence of Tregs(n=6); *P<0.001 compared with C-siRNA

2.4 LRCH1維持IL-2信號轉導的活化

如圖5，IL-2處理20 min后，L-si RNA組Tregs內p-STAT5水平較C-siRNA降低；而在Lrch1敲低的Tregs內，p-STAT5水平受到抑制(圖5)。

A:Western blot images showing phosphorylated STAT5 in C57BL/6 mouse splenic Tregs after IL-2 treatment for different time intervals, C-siRNA.Tregs transfected with scramble control siRNA, L-siRNA.Tregs transfected with LRCH1 siRNA;B:statistical analysis of STAT5 phosphorylation level relative to the group of IL-2 treatment for 0 min(n=5); *P<0.01 compared with L-siRNA

3 討論

以往研究提示系統性紅班狼瘡(SLE)患者存在外周血Tregs數量減少、Foxp3表達降低或分泌的細胞因子異常[6-7]。本研究首次揭示了LRCH1對Tregs功能的影響。MRL/lpr小鼠腎臟局部環境誘導LRCH1在Tregs的表達增高，但具體是何種因子尚不清楚。Lrch1的啟動子區域含有AhR、Arnt、Cart-1、FOXJ2、等轉錄因子的結合位點(https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=LRCH1)。本研究團隊下一步的研究將圍繞這些轉錄因子所參與的信號途徑來揭示LRCH1表達的調控機制。有證明在潰瘍性結腸炎，LRCH1抑制CD4+T 細胞的遷移[8]。雖然本研究未檢測Tregs的遷移，但今后也將對此做進一步的探討。

本研究提示LRCH1對Tregs的功能起正調控作用，基因敲除實驗顯示LRCH1通過維持IL-2信號途徑的活化從而穩定Foxp3的表達，繼而維持Tregs的免疫抑制功能，使Tregs能夠通過分泌IL-10和TGF-β等免疫抑制分子減輕自身免疫反應和炎性反應。以往有報道顯示，LRCH1缺失可促進CD8+T細胞活化連接蛋白(linker for activation of T-cell，LAT)信號傳導及CD8+T細胞的抗病原和抗腫瘤應答[9]，可見在不同的細胞類型LRCH1的作用效果可以是截然相反的，提示有可能是因為LRCH1參與了不同的信號途徑。此外，LAT信號途徑對Tregs的功能十分重要[10]，因此，將來也應該檢測LRCH1對Tregs內LAT信號途徑的影響。

綜上所述，LRCH1是狼瘡腎炎浸潤性Tregs的重要調控分子。對LRCH1的研究為臨床上理解狼瘡腎炎的進展機理和制定治療方案提供了新的思路。