流式細胞術在成熟B 細胞淋巴瘤診斷中的應用

劉新蕾，周慷，肖洪波，唐宏煒

重慶醫科大學附屬第二醫院血液內科，重慶 400000

淋巴瘤是淋巴結或淋巴組織的惡性腫瘤，因其臨床表現的多樣性及建立診斷的復雜性使得該病的診斷具有一定的挑戰性。世界衛生組織（World Health Organization,WHO）在對淋巴腫瘤性疾病的界定中指出，對淋巴瘤的診斷需要病理形態學（活檢、骨髓及血細胞形態學）、免疫組織化學（免疫表型）、流式細胞術（flow cytometry,FC）、細胞遺傳學以及結合臨床表現綜合診斷和多學科參與[1]。目前，病理學診斷仍是確診淋巴瘤的金標準，但其有一定的局限性，包括操作復雜且耗時長，不能滿足對進展快和特殊部位的淋巴瘤快速診斷、及時治療的要求等。而流式細胞術能夠快速識別多種、體量較大的細胞群，判斷細胞的克隆性，且耗時少，可實現快速診斷[2]。其中，多參數流式細胞術（multipa‐rameter flow cytometry,MFC）在臨床上廣泛用于評估復雜的細胞混合物[3]。同時流式細胞術還可用于微小殘留病變（minimal residual disease,MRD）的監測，MRD 檢測對血液病患者的治療管理具有顯著影響。MFC-MRD 診斷為表型識別耐藥/復發性腫瘤細胞提供了獨特的機會，為臨床工作者在制訂治療決策時提供了方向[4]。本文主要介紹流式細胞術在成熟B 細胞腫瘤的應用。

1 成熟B 淋巴細胞腫瘤

B 淋巴細胞增生性疾?。˙-lineage lymphoprolif‐erative disorders,B-LPD）中普遍存在的CD19 表達是應用流式細胞術的第一個強制性門控步驟，然后通過輕鏈限制性檢測和抗原錯譯表達（特別是泛T 抗原CD5 的表達）來確定異常的成熟B 淋巴細胞[5]。

1.1 CD5+小細胞成熟B 淋巴細胞腫瘤

慢性淋巴細胞白血病/小細胞淋巴瘤（chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma,CLL/SLL），是一種由單克隆成熟小B 細胞組成的B細胞腫瘤[6]。通過血液流式細胞術足以診斷CLL/SLL，通常不需要活組織檢查。CLL/SLL 的免疫表型通常為一種輕鏈限制性表達（kappa 或lambda）和B 細胞抗原受體（B-cell antigen receptor,BCR）相關復合物的弱表達。典型的CLL/SLL 免疫表型包括：CD5+、CD23+、CD43+/-、CD10–、CD19+、CD20 弱陽性、slg 弱陽性、cyclinD1–。需要注意的是，某些病例可能是slg 強陽性，CD23-或弱陽性，有些套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma,MCL）可能出現CD23+，因此，在所有CLL/SLL 患者中應考慮進行免疫組織化學檢測cyclinD1 或FISH 檢測t（11，14），并且應該在具有非典型免疫表型（即CD23 弱陽性或陰性、CD20+、sIg+）的患者中進行[7]。CD200 是鑒別CLL 和MCL 的較特異的免疫表型，CD200 對CLL 的敏感性很高[8]，CLL 的研究幾乎普遍顯示，CD200 陽性率高于97%，大多數報告接近99%，而在MCL 的CD200的表達普遍為陰性。一旦CLL/SLL 的診斷成立，對預后標志物的檢測十分重要。目前普遍接受的能夠預測CLL 患者預后的指標包括免疫球蛋白重鏈可變（immunoglobulin heavy chain variable,IGHV）基因、CD49d 和ZAP-70/CD38 表達的體細胞突變，以及染色體異常（染色體13q、17p 和11q 缺失以及12三體）和TP53、ATM、NOTCH1、BIRC3 和SF3B1 基因復發突變的鑒定[9]。不表達ZAP-70 或CD38 的CLL/SLL 患者預后更好[10]。沒有免疫球蛋白重鏈可變基因（immunoglobulin heavy chain variable region,IgVH）突變的CLL 患者中白血病細胞表達高水平的ZAP-70，而具有IgVH 突變的CLL 患者中白血病細胞幾乎不表達ZAP-70[11]。在一線治療中，非突變重鏈基因對BTK 抑制劑的反應比化療更好[12]。與ZAP-70 流式細胞術評估相比，CD49d 檢測容易區分陽性和陰性患者，從而實現可靠的預后風險分層[9]。治療期間和治療后可測量的殘留病灶（measurable re‐sidual lesions,MRD）的準確量化對于預測CLL 治療的臨床結果至關重要。MRD 是化學免疫療法和同種異體移植后無進展生存期（progression free sur‐vival,PFS）和總生存期（overall survival,OS）的獨立預后標志物，可用于決定低風險遺傳學患者何時停止治療，目前已成為評估臨床終點前隨機試驗治療效果的一個公認替代指標[13]。

套細胞淋巴瘤來源于淋巴濾泡外套區生發中心前的B 細胞，臨床上多數患者表現為Ⅲ或Ⅳ期，常常累及骨髓和外周血，免疫表型較特異，結合標志性細胞遺傳學/分子生物學檢測可以確診。通常具有標 志性的t（11，14）（q1，q32）染色體異位、CCND1 基因與免疫球蛋白重鏈（immunoglobulin heavy chain,IGH）基因座，引起促進細胞增殖的細胞周期蛋白D1 的過度表達，最終導致細胞周期紊亂和侵襲性淋巴瘤的形成。作為B 細胞淋巴瘤，MCL 表達CD19、CD20、CD21、CD22、CD79a、表面Ig（通常為IgM 和IgD）、FMC-7、B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2,BCL-2）、CD23 和CD200 陰性[2]。CD19 和CD20 之間的表達強弱與CLL 相反，具有一定的鑒別意義。但也有CD23 陽性的報道，Saksena Annapurna 等[14]報告103 例（13%）MCL 患者CD23 弱陽性。CD23+MCL 淋巴瘤患者有白細胞計數增加、骨髓受累和白血病表現。值得注意的是，CD23+MCL 通常與CD200+和弱SOX11 表達相關。盡管CD23+MCL 患者的白血病表現與CLL 相似，但其預后優于CD23-患者。另外，Vockova Petra 等[15]的研究指出CD31 與結外/髓外受累（E/E）的參與程度呈正相關。CD31 的高表達可能促進E/E 組織中MCL 細胞的擴散、植入和/或存活。

1.2 CD5-成熟B 淋巴細胞腫瘤

WHO 定義淋巴漿細胞淋巴瘤（Lymphoplasma‐cytic lymphoma,LPL）是由小B 淋巴細胞、漿細胞樣淋巴細胞和漿細胞組成的淋巴瘤，常侵犯骨髓，也侵犯淋巴結和脾臟，且不符合其他可能伴漿細胞分化的小B 細胞淋巴瘤[6]。當LPL 侵犯骨髓且伴單克隆IgM 血癥（不論數量）時，則應診斷為華氏巨球蛋白血癥（waldenstrfim macroglobulinemia,WM），LPL最重要的特征是具有MYD88 L265P 突變[16]。WM是一種少見的以血清單克隆IgM 為主要特征的惰性淋巴細胞腫瘤[17]。其免疫表型通常為CD19+、CD20+、CD22+、CD25+、CD27+、FMC7+、CD5+/-、CD10-、CD23-、CD103-。10%～20% 的患者 可部分表達CD5、CD10、CD23，此時不能僅憑免疫表型排除WM[18]?？梢娖淞馨土龅某煞直容^復雜，抗原表達上具有高度特異性，表達B 細胞相關抗原有漿細胞成分時可有CD138 的表達。因此，流式細胞術對LPL/WM 有輔助診斷的價值，確診需要聯合單克隆IgM、骨髓形態以及MYD88 基因檢測。

濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma,FL）通常是一種由濾泡中心B 細胞轉化而成的惰性B 細胞淋巴增生性疾病。FL 的臨床表現不具特征性，需經淋巴結病理活檢確診，流式細胞術僅作為輔助診斷方式。幾乎所有FL 均為CD19、CD20、CD22、CD79a 和CD10 陽性（60%），且缺乏CD5、CD43（大多數病例）和CD11c 的表達[14,19]。FL 流式細胞術的免疫表型分析通常顯示CD10+B 細胞表達單克隆免疫球蛋白輕鏈，而免疫組織化學通常顯示濾泡被CD10+、BCL6+、BCL2+B 細胞占據。在85%～90%的濾泡性淋巴瘤中，疾病進展過程中存在BCL2 重排，導致BCL2 過度表達[1,5]。

毛細胞白血?。╤airy cell leukemia,HCL）是一種少見的慢性克隆性B 細胞增殖性疾病，患者多無癥狀，以貧血、出血、肝脾腫大即外周血及骨髓出現大量邊緣不齊呈偽足或纖毛樣突出的白細胞為特征[20]。HCL 具有高頻率IGHV 突變的克隆B 細胞和較常見的BRAF V600E 突變。因HCL 具有較為獨特的免疫表型，其診斷通常通過骨髓活檢和流式細胞術。流式細胞術顯示HCL 具有高水平的CD19、CD20 和CD22 的表達，同時常表達CD11c、CD103 整合素、CD25 以及CD123，CD5、CD23、CD10 和CD27呈陰性或弱表達[21]。CD11c、CD25、CD103 和CD123可用于區分HCL 和其他B 細胞疾病。其他標記物，如CD27、CD43、CD81 和CD200 在HCL 和HCL-V 中的表達不同，反映其不同的疾病生物學特性[22]。CD27 和CD38 在經典HCL 中通常為陰性，這使其區別于其他淋巴增生性疾病[23]。因毛細胞白血病獨特的免疫表型，可利用免疫組織化學（Immunohisto‐chemistry,IHC）和MFC 評估MRD。

B 幼淋巴細胞白血病（B-cell prolymphocytic leu‐kemia,B-PLL）是一種罕見的B 細胞慢性淋巴細胞增生性疾病（B-cell chronic lymphoproliferative dis‐ease,BCLPD），PLL 的顯著特征是具有核染色質濃集卻有大而明顯的單個核仁，特異性的形態結合流式細胞術（flow cytometry,FC）仍然是診斷B-PLL 的可靠方法。PLL 表型特征包括有或沒有SIgD、CD19、CD20、CD22、人類白細胞DR 抗原（human leu‐kocyte antigen DR,HLA-DR）、CD79b、FMC7 的表達和克隆型Ig 輕鏈強表達，但缺少CD5 和CD23 的表達[24]。盡管CLL 和B-PLL 通常能夠通過流式細胞術進行區分（最有用的標記物為CD79b、SIgM、CD200、CD27、CD39 和CD5），但與MCL 和B-PLL 的標記物仍有部分重疊。

邊緣區淋巴瘤（marginal zone lymphoma,MZL）是惰性B 細胞淋巴瘤，約占非霍奇金淋巴瘤的10%。MZL 的特征是從黏膜相關淋巴組織（mucosa associated lymphoid tissue,MALT）、淋巴結和脾臟中發現B 細胞濾泡邊緣區增殖。在最近的WHO 分類中將其分為3 種不同的類型：黏膜相關淋巴組織結外邊緣區淋巴瘤（MALT 淋巴瘤）、脾臟MZL（SMZL）和淋巴結MZL（NMZL）。MALT 淋巴瘤細胞顯示泛B 細胞標記，如CD19、CD20 和CD79a，同時淋巴瘤細胞表達邊緣帶相關抗原CD21 和CD35，而CD5、CD10、CD23 和細胞周期蛋白D1 呈陰性表達，這有助于區 分MZL 與CLL/SLL、FL 和MCL。然 而，約20%～25%的MZL 可表達CD5[25]，這種抗原的表達通常與淋巴細胞增多和彌漫性骨髓浸潤相關，但不影響預后。SMZL 免疫組化顯示成熟的B 淋巴細胞表達CD20 和CD79，不表達cyclinD1、CD10 和BCL6。流式細胞術檢測到SMZL 細胞為CD24+、CD27+和FMC7+。典型的CD22 和CD11c 染色，但不如其他脾淋巴瘤（SDRPL 或HCL）明亮。CD123 為陰性，在極少數情況下CD103 可能為微弱陽性。免疫組化及流式細胞術均提示膜聯蛋白A1 和CD25 為陰性。另外，在流式細胞術和免疫組織化學組中添加CD180 可以更好地對成熟B 淋巴瘤進行分類，其對MZL 的敏感性和特異性分別為75%和90%[26]，這也使CD180 成為MZL 中有用的免疫標記物。此外，高強度的CD180 染色可能有利于診斷起源于脾的淋巴瘤，因為SMZL 和脾臟彌漫紅髓小B 細胞淋巴瘤（SDRPL）在流式細胞術中顯示出特別高水平的CD180 表達[27]。

1.3 彌漫性大B 細胞淋巴瘤（diffuse large B cell lym?phoma，DLBCL）

彌漫性大B 細胞淋巴瘤是最常見的非霍奇金淋巴瘤，具有侵襲性，患者通常表現為淋巴結迅速擴大和全身癥狀，需要立即治療。形態學上，DLBCL 的特征是彌漫性浸潤中大型細胞，核仁大，細胞質豐富，破壞并抹去受累淋巴結的基本結構[28]。應用流式細胞術分析該腫瘤無特征性免疫表型，DLBCL 通常表達泛B 細胞抗原，包括CD19、CD20、CD22、CD79a 和CD45。大多數細胞也表達表面免疫球蛋白（immunoglobulin,IG）。Espasa Andrea等[29]檢測CD71、CD81、CD44 和CD39 在B 細胞淋巴瘤中的表達時指出，CD71 的高表達提示大細胞淋巴瘤，尤其是在CD10 陰性的情況下，CD10 陰性DLBCL 中CD39 高表達，CD10 陽性DLBCL/HGBL 中CD39 低表達。Stacchini Alessandra 等[30]報道了5 例CD56+DLBCL，其起源于生發中心，明顯傾向于結外受累。根據他們的發現和文獻資料，CD56 表達似乎優先與生發中心起源的B 淋巴瘤相關。盡管FCM 在大B 細胞淋巴瘤中的診斷作用有限，但流式分析可以快速找到組織中的克隆性B 細胞，結合細胞形態和臨床侵襲性過程能盡早明確診斷，為部分患者爭取治療的時間。同時，一項系統評價指出DLBCL 中CD30 陽性的表達可能與更高的存活率和更好的預后相關，也為這部分患者提供新的治療靶點[31]。2017 年WHO 分類要求將彌漫性大B 細胞淋巴瘤，非特殊性分型（DLBCL,NOS）分為生發中心B細胞型（GCB）或非GCB 類型，通過CD20、CD10、bcl-6 和MUM-1（IRF4）的表達與否來確定彌漫大B細胞起源于GCB 還是非GCB。一般認為CD10+/-，BCL-6+，MUM1-為GCB，其余為非GCB[28]。

1.4 伯基特淋巴瘤（burkitt lymphoma，BL）

伯基特淋巴瘤臨床侵襲性強，通常以結外受累或急性白血病的形式出現。目前無單一參數能作為診斷的金標準。BL 來源于生發中心B 細胞，其發育依賴于MYC 基因的表達，該基因編碼c-myc 蛋白轉錄因子，該轉錄因子位于染色體8q24 上并調節細胞增殖、分化和凋亡[32]。組織學上，BL 通常呈彌漫的生長方式，BL 表現出“滿天星”圖像，瘤細胞間有散在的組織細胞分布。通常能觀察到較高的增殖率和細胞凋亡率，即高分裂指數和高凋亡的特征性病變。免疫表型檢測，BL 細胞表達膜IgM，有輕鏈限制性以及B 細胞相關標志（CD19、CD20、CD22等）和生發中心標志（CD10、BCL6）。CD38、CD43 的陽性率也較高。幾乎全部的BL 強表達MYC 蛋白（所有細胞），高增殖活性KI67 大于90%。腫瘤細胞通常不表達CD5、CD23、CD138、BCL2 和TdT[33]。流式細胞術能快速得到結果，結合形態學表現大致可以推斷BL 的診斷，為高度進展患者及時治療提供有力的證據。

2 總結與展望

淋巴瘤是一類高度異質性的腫瘤，其臨床表現差異大，對于大多數血液系統惡性腫瘤，形態學/細胞學特征的知識對于鞏固綜合診斷和指導進一步的細胞遺傳學和分子研究是非常重要的，流式細胞術更是診斷各種樣本中血液系統腫瘤的一種快速有效的工具，也是建立B 細胞克隆性最方便、最有力的手段之一，因此，以臨床為基礎的多學科綜合診斷治療是未來淋巴瘤診治的發展方向。