依據(jù)CLSI EP07-A3文件評(píng)價(jià)血清指數(shù)對(duì)免疫散射比濁法檢測(cè)前白蛋白的干擾

韓 光，徐瓊峰，段淑敏，駱嘉歡，王云秀，張秀娟，萬(wàn)澤民，柯培鋒，黃憲章

（1.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2.中國(guó)南方航空股份有限公司航空衛(wèi)生中心，廣東 廣州 510400；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)金沙洲醫(yī)院，廣東 廣州 510168；4.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州 510120）

血清樣本的質(zhì)量是臨床檢測(cè)中常見(jiàn)的干擾因素。血清指數(shù)是指對(duì)脂濁（濁度）、溶血[血紅蛋白（hemoglobin，Hb）]和黃疸（膽紅素）的定量或半定量估計(jì)值[1]。血清指數(shù)較高會(huì)對(duì)較多項(xiàng)目檢測(cè)產(chǎn)生干擾[2]，嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。前白蛋白（prealbumin，PA）由于相對(duì)分子質(zhì)量小、半衰期短、敏感性高，對(duì)診斷早期肝功能損傷有重要價(jià)值，同時(shí)也是衡量肝功能損傷患者預(yù)后的良好指標(biāo)[3]。免疫散射比濁法是測(cè)定PA的常用方法，也是推薦方法[4]。本研究參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP07-A3文件[5]，探討不同濃度的內(nèi)源性干擾物質(zhì)對(duì)免疫散射比濁法檢測(cè)PA是否能產(chǎn)生干擾，以及干擾誤差的大小和方向，以明確免疫散射比濁法檢測(cè)PA的血清指數(shù)限定值，并據(jù)此建立不合格樣本的退檢標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料和方法

1.1 樣本來(lái)源

收集廣東省中醫(yī)院體檢者體檢當(dāng)天的新鮮血清樣本作為基礎(chǔ)樣本，依據(jù)CLSIEP07-A3文件要求，樣本無(wú)肉眼可見(jiàn)的溶血、脂血、黃疸，且三酰甘油（triglyceride，TG）、膽紅素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）均處于參考區(qū)間內(nèi)，PA檢測(cè)值為100～400 mg/L。

1.2 儀器與試劑

cobas c702全自動(dòng)生化分析儀（瑞士羅氏公司）。血清指數(shù)檢測(cè)試劑（分光光度法，批號(hào)0768707）購(gòu)自瑞士羅氏公司。PA試劑（免疫散射比濁法，批號(hào)2019021B）購(gòu)自上海科華公司。人膽紅素參考物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品干粉由深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司惠贈(zèng)。

1.3 干擾物配制

1.3.1 干擾樣本和對(duì)照樣本 干擾樣本為基礎(chǔ)樣本添加一定濃度的干擾物質(zhì)，對(duì)照樣本為基礎(chǔ)樣本添加等體積的干擾物質(zhì)的溶劑。加入的干擾物體積不超過(guò)測(cè)試物總體積的5%。干擾物體積所占比例見(jiàn)表1。

1.3.2 干擾物配制 （1）Hb配制：將體檢者全血樣本破壞紅細(xì)胞后離心，取上層Hb，獲得Hb濃縮液。（2）膽紅素配制：在純化的人膽紅素參考物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品干粉中加入0.1 mol/L NaOH。（3）脂濁濃縮液：收集脂濁樣本，用低溫高速離心機(jī)4 ℃、6 574×g離心30 min，洗滌后收集上層濃縮的脂質(zhì)，獲得脂濁濃縮液。

1.3.3 干擾物濃度確定 Hb和脂質(zhì)均采用血清指數(shù)檢測(cè)試劑確定干擾物濃度，膽紅素干擾物濃度通過(guò)計(jì)算得出。脂濁干擾物（以TG為代表）濃度一般為16.90 mmol/L[6]，本研究采用的脂濁工作液中的TG濃度為5.15 mmol/L，脂濁指數(shù)為988，雖低于常見(jiàn)脂濁干擾物（TG）濃度，但已達(dá)臨床高值。干擾物濃度見(jiàn)表1。

表1 干擾物配制基本情況

1.4 配對(duì)差異實(shí)驗(yàn)

1.4.1 重測(cè)次數(shù)的計(jì)算 計(jì)算最大允許干擾值（dmax）與批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差（s）的比值，查dmax/s比值與重測(cè)次數(shù)對(duì)應(yīng)表。重復(fù)測(cè)定10次基礎(chǔ)樣本，計(jì)算批內(nèi)s。dmax為各項(xiàng)目臨床意義差異的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.2dmax的確定 依據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心2019年臨床檢驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃，PA的允許總誤差（allowable total error，TEa）為25%，本研究設(shè)定PA的dmax為樣本均值（x）±1/3 TEa[7]，即樣本±8.33%。

1.4.3dobs的確定dobs為測(cè)試樣本均值（T）和對(duì)照樣本（C）均值之間的差值。dc為對(duì)照樣本最大允許偏移。通過(guò)公式計(jì)算Cut-off值dc（雙側(cè)檢驗(yàn)）[5]。如|dobs|≤Cut-off值dc，可以得出某種物質(zhì)引起的偏移＜dmax，對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著影響；反之則說(shuō)明由該物質(zhì)引起干擾的假設(shè)成立。

1.5 劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

1.5.1 樣本準(zhǔn)備 干擾樣本和對(duì)照樣本分別記為高濃度脂濁血清（A）和低濃度脂濁血清（B）。按照B、3/4B+1/4A、1/2B+1/2A、1/4B+3/4A、A配制成5個(gè)濃度的測(cè)試樣本。

1.5.2 重測(cè)次數(shù)的計(jì)算 重測(cè)次數(shù)的計(jì)算步驟與配對(duì)差異實(shí)驗(yàn)一致。要求5個(gè)濃度的測(cè)試在同一個(gè)分析批內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，為了平均系統(tǒng)偏移，第1次測(cè)定時(shí)測(cè)試樣本濃度由低到高，第2次測(cè)試時(shí)測(cè)試樣本濃度由高到低，第3次測(cè)試時(shí)測(cè)試樣本濃度由低到高。

1.5.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)果判斷與配對(duì)差異實(shí)驗(yàn)一致。以1/3 TEa（8.33%）為判斷標(biāo)準(zhǔn)，以干擾率＞8.33%為產(chǎn)生干擾。

2 結(jié)果

2.1 配對(duì)差異實(shí)驗(yàn)

2.1.1 重測(cè)次數(shù) 計(jì)算dmax/s比值后，查表得到樣本重測(cè)次數(shù)為3次。PA高、低值樣本的dc分別為6.60和2.19 mg/L。見(jiàn)表2。

表2 PA高、低值樣本的dmax/s比值和dc

2.1.2 干擾效應(yīng)分析 在PA高、低值樣本中，加入10 g/L Hb（溶血指數(shù)為1 000）、200 mg/L（340 μmol/L）膽紅素（黃疸指數(shù)為20）對(duì)免疫散射比濁法檢測(cè)PA無(wú)干擾，加入脂濁指數(shù)為988的脂濁干擾物后對(duì)PA檢測(cè)有負(fù)干擾。見(jiàn)表3。

表3 配對(duì)差異實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

隨著脂濁指數(shù)的逐漸增大，脂濁對(duì)免疫散射比濁法PA檢測(cè)的干擾率逐步增大。見(jiàn)圖1。

圖1 脂濁對(duì)PA干擾的劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

對(duì)于PA低值樣本，排除最高濁度可能產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)引起的檢測(cè)偏差，脂濁指數(shù)為0～342時(shí)與干擾率呈線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為Y=-0.077X+0.979（r2=0.999）。以1/3 TEa（8.33%）作為干擾的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)線(xiàn)性方程計(jì)算出脂濁指數(shù)為120，即脂濁指數(shù)≤120時(shí)，對(duì)PA檢測(cè)無(wú)顯著干擾。見(jiàn)表4。

表4 脂濁對(duì)PA低值樣本的劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)于PA高值樣本，脂濁指數(shù)為0～516時(shí)與干擾率呈線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為Y=-0.040X-0.168（r2=0.992）。以1/3 TEa（8.33%）作為干擾的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)線(xiàn)性方程計(jì)算出脂濁指數(shù)為203，即脂濁指數(shù)≤203時(shí)對(duì)PA檢測(cè)無(wú)顯著干擾。見(jiàn)表5。

表5 脂濁對(duì)PA高值樣本的劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

溶血、黃疸和脂血是常見(jiàn)的干擾臨床檢測(cè)的因素。試劑廠(chǎng)商一般會(huì)將常見(jiàn)的血清指數(shù)干擾結(jié)果納入試劑配置參數(shù)中。但如果使用非配套檢測(cè)系統(tǒng)，或試劑廠(chǎng)商未做相關(guān)血清指數(shù)干擾的研究，那么溶血、黃疸和脂血導(dǎo)致的干擾就會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。為此，本研究分析了在非配套檢測(cè)系統(tǒng)中，血清樣本質(zhì)量對(duì)免疫散射比濁法檢測(cè)PA產(chǎn)生的干擾。

本研究使用的PA試劑說(shuō)明書(shū)中聲明：樣本中Hb＜12 g/L、膽紅素＜700 mg/L、脂類(lèi)＜1 000 mg/L對(duì)PA測(cè)定無(wú)干擾，但極度脂血影響較大。本研究參照CLSI EP07-A3文件，采用配對(duì)差異實(shí)驗(yàn)和劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)對(duì)非配套檢測(cè)系統(tǒng)的抗干擾能力進(jìn)行了驗(yàn)證。

干擾物的選擇應(yīng)盡量與臨床實(shí)際干擾物一致，因此本研究溶血干擾物選擇Hb，黃疸干擾物選擇膽紅素；在臨床高脂濁樣本中，產(chǎn)生影響的微粒除了TG外，還包括極低密度脂蛋白[8]，且脂濁指數(shù)與TG水平的相關(guān)性較差，因此本研究未使用TG作為脂濁干擾物，而是采用分離自脂濁樣本的脂質(zhì)層作為脂濁干擾物，血清濁度也采用脂濁指數(shù)表示，更加貼近臨床脂濁樣本。本研究配對(duì)差異實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10 g/L Hb和340 μmol/L膽紅素對(duì)PA檢測(cè)無(wú)顯著干擾，與試劑說(shuō)明書(shū)聲明基本一致。但該試劑對(duì)脂濁的抗干擾能力不強(qiáng)，試劑說(shuō)明書(shū)聲明脂類(lèi)＜1 000 mg/L對(duì)PA測(cè)定無(wú)干擾，但極度脂血影響較大。本研究結(jié)果顯示，脂濁對(duì)PA高、低值樣本均有負(fù)干擾，因此采用劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定干擾物濃度和干擾率之間的關(guān)系。

在脂濁對(duì)PA低值樣本的劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，可能是由于產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)或其他原因引起了檢測(cè)偏差，導(dǎo)致高濃度脂濁，產(chǎn)生的干擾率結(jié)果呈現(xiàn)明顯的離群現(xiàn)象，排除此離群值后，顯示脂濁濃度與干擾率呈線(xiàn)性關(guān)系。以1/3 TEa（8.33%）為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，在PA低值樣本的檢測(cè)中，脂濁指數(shù)＞120即可對(duì)PA檢測(cè)產(chǎn)生干擾；在PA高值樣本的檢測(cè)中，脂濁指數(shù)＞203可對(duì)PA檢測(cè)產(chǎn)生干擾。

本研究的不足之處在于PA高值基礎(chǔ)樣本未能覆蓋行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[9]中PA的男性參考區(qū)間上限（430 mg/L），后續(xù)將繼續(xù)收集PA高值樣本進(jìn)行相關(guān)研究。

綜上所述，臨床常見(jiàn)的溶血和黃疸樣本不會(huì)對(duì)免疫散射比濁法檢測(cè)PA造成干擾，但脂濁指數(shù)L＞120的樣本會(huì)對(duì)PA檢測(cè)造成負(fù)干擾。