間接法建立上海地區新生兒G6PD篩查臨界值的可行性

紀 偉，田國力，朱之星，周 卓，王燕敏，張瀟分

（1.上海市兒童醫院 上海交通大學附屬兒童醫院新生兒篩查中心，上海 200040；2.上海市兒童醫院 上海交通大學附屬兒童醫院生物醫學信息研究中心，上海 200040）

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD） 缺乏癥為常見的X染色體連鎖不完全顯性遺傳病，是新生兒高膽紅素血癥常見和重要的危險因素之一，嚴重者可引起新生兒膽紅素腦病，影響患兒智力發育，導致嚴重后遺癥，甚至危及生命[1]。G6PD缺乏癥患兒血液中G6PD水平會顯著降低，通過檢測新生兒G6PD水平，可早期篩查出大部分患兒并盡早干預，最大限度地降低疾病的影響[2]。G6PD缺乏癥有顯著的地域分布，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）建議在男性患病率＞3%的地區常規開展產前健康教育及新生兒篩查[3-4]，但隨著人口的流動，這些地區患病率也逐漸增高。從2007年起，上海地區全面開展新生兒G6PD缺乏癥篩查，采用定量熒光法檢測濾紙干血片中的G6PD水平，結果顯示上海地區新生兒G6PD缺乏癥的發病率為0.18%[5]。從2018年起，上海市兒童醫院新生兒篩查中心開始采用全自動新生兒疾病篩查（genetic screening processor，GSP）系統檢測G6PD，以前期臨床驗證階段小樣本建立的220 U/L作為臨界值（Cut-off值），以G6PD＜臨界值判定為篩查陽性[6]。本研究擬基于大樣本數據，采用間接法建立G6PD的篩查臨界值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年6月—2020年6月上海市兒童醫院新生兒篩查中心行G6PD缺乏癥篩查的新生兒134 747名，其中男70 310名、女64 437名，日齡為2～30 d，體質量為1 350～5 400 g，母親孕周為33～44周。所有新生兒均于出生48 h后采用針刺足跟的方法制備濾紙干血片。

1.2 儀器與試劑

2021-0010型全自動熒光免疫分析儀GSP（美國PerkinElmer公司）及配套G6PD試劑、質控品和校準品（簡稱GSP系統）。室內質量控制采用Westgard多規則（13s和22s），確保質控在控。本實驗室參加美國疾病預防控制中心、中國臺灣預防醫學會和國家衛生健康委臨床檢驗中心組織的新生兒G6PD缺乏癥篩查室間質量評價計劃，成績均合格。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件和R軟件進行統計分析。采用 Kolmogorov-Smirnov檢驗進行正態性分布分析，不同性別之間比較采用Z檢驗。呈非正態分布的計量資料以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示。將偏態分布數據采用Box-Cox轉換成近似正態分布。采用四分位間距（Turkey）法剔除±1.5倍四分位距（interquartile range，IQR）以外的數據，即離群值[7]。采用R語言basicTrendline（https：//CRAN.R-project.org/package=basicTrendline）軟件包繪制累計頻率分布圖，對任意2點間的數據進行無限循環，循環條件設為同時滿足最小殘差平方和占累積分布最大百分比的線性部分，直到識別出最佳線性。

因新生兒G6PD缺乏癥篩查以G6PD水平降低為異常，因此按新生兒疾病篩查指標臨界值建立原則[8]，本研究以參考區間下限[單邊第5百分位數值（P5）]作為篩查臨界值。將篩查臨界值分別與廠商聲明的參考區間下限和本實驗室臨床驗證階段采用小樣本建立的臨界值作比較，計算相對偏差，并與參考變化值（reference change value，RCV）進行比較，RCV公式計算為：RCV=21/2×Z×（CVA2+CVI2）1/2，式中（CVA2+CVI2）1/2表示濾紙干血片G6PD檢測的不精密度，其結果來自westgard網站（http：//www.westgard.com/biodatabase1.htm）；Z表示差異的95%可能性概率值，取值為1.96。以相對偏差＜RCV為兩者差異無統計學意義，相對偏差＞RCV為兩者差異有統計學意義。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 新生兒篩查總體情況

134 747名新生兒中篩查陽性352例，采用G6PD/6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶比值法或基因檢測確診G6PD缺乏癥233例，其中男210例、女23例，G6PD缺乏癥發病率為1∶579。

2.2 入組新生兒基本信息

Kolmogorov-Smirnov檢驗結果顯示，G6PD數據呈偏態分布。134 747名新生兒中去除G6PD缺乏癥患兒233例（0.17%）和確診為其他遺傳代謝病患兒141例（0.10%），剩余數據經Box-Cox轉換成近似正態分布，然后采用Turkey法剔除離群值793個（0.59%），最終入組新生兒為133 580名。見表1。

表1 入組新生兒基本信息

2.3 采用間接法建立G6PD參考區間

Z檢驗結果顯示，男嬰與女嬰之間G6PD水平差異有統計學意義（P＜0.000 1）。將男嬰和女嬰G6PD檢測結果用Box-Cox轉換成近似正態分布曲線，見圖1。以累積頻率作為橫坐標，G6PD檢測結果為縱坐標，對任意2點間數據進行無限循環擬合，得出的最佳線性曲線見圖2。根據擬合線性方程，以P5為臨界值，求得男嬰G6PD的臨界值為317.8 U/L、女嬰為325.7 U/L。見表2。

圖1 男嬰和女嬰G6PD檢測結果的頻率分布直方圖

圖2 男嬰和女嬰G6PD檢測結果的累計頻率分布曲線

表2 間接法建立的G6PD篩查臨界值

2.4 根據篩查臨界值計算的相對偏差與RCV的比較結果

濾紙干血片G6PD的RCV為10.26%。無論是男嬰還是女嬰，采用間接法建立的篩查臨界值與廠商聲明的參考區間下限及本實驗室依據小樣本建立的臨界值的相對偏差均高于RCV。見表3。

表3 篩查臨界值與廠商聲明、小樣本臨界值的相對偏差及與RCV的比較結果

2.5 間接法建立的G6PD篩查臨界值的驗證

233例G6PD缺乏癥患兒中男嬰210例，G6PD水平為15.3～258.5 U/L；女嬰23例，G6PD水平為24.7～312.9 U/L，均低于相應臨界值。

回顧分析2018年6月—2020年6月中國臺灣預防醫學會新生兒G6PD篩查院際品質保證計劃的7批70份樣本結果，其中陽性樣本19份、陰性樣本51份，以間接法建立的G6PD篩查臨界值作為判斷標準，陰性、陽性的符合率均為100%。見圖3。

圖3 室間質量評價樣本檢測結果

3 討論

新生兒G6PD缺乏癥篩查通過實驗室方法檢測濾紙干血片上G6PD濃度，把可疑患兒在新生兒期篩查出來，再進一步采用定量比值法或基因檢測方法明確診斷，盡早干預，以最大限度地降低疾病對患兒的影響[9]。本研究采用GSP系統對上海地區出生的134 747名新生兒進行G6PD缺乏癥篩查，確診233例患兒，得出上海地區G6PD缺乏癥的發病率為1∶579，與采用定量熒光法得出的上海地區發病率[10]基本一致。G6PD缺乏癥為X染色體連鎖不完全顯性遺傳病，男性患兒為酶活性顯著缺乏的半合子，女性患兒雜合子可表現為G6PD活性接近正常或正常。本研究確診男嬰210例、女嬰23例，男嬰例數遠高于女嬰。由于以G6PD為指標的新生兒篩查是篩查有“表現型”的G6PD缺乏癥[11]，因此女嬰的實際發病率可能更高。

臨界值是指某被測物在健康人群中的上限值或下限值，用于判斷罹患疾病的風險，也是新生兒篩查工作中疾病診斷和治療的重要依據，臨界值是否準確直接影響著新生兒篩查實驗室的工作質量。新生兒篩查實驗室一般先建立健康新生兒中相應指標的參考區間，然后根據篩查疾病的特點，將參考區間的下限或上限定義為臨界值[12]。G6PD缺乏癥患兒血G6PD水平降低，故新生兒G6PD缺乏癥的篩查是以G6PD低于臨界值為陽性。如果臨界值設定偏低，易導致假陰性，直接導致漏診；如果設置偏高，易導致過多假陽性，造成人力、物力的極大浪費。2015年，我國國家衛生健康委臨床檢驗中心對全國88家開展G6PD缺乏癥篩查的臨床實驗室的調查結果顯示，G6PD臨界值為2.0～10.0 U/g Hb，是以每克血紅蛋白中G6PD的含量為單位[13]。從2017年起，具有洗脫控制環節的GSP系統逐步被應用于臨床，其G6PD的單位為U/L，直接反映了全血中G6PD的活性，特別是對于貧血等低色素新生兒，準確度更高[6]。2020年，中國臺灣預防醫學會的新生兒G6PD缺乏癥篩查室間質量評價計劃結果顯示，全球參加該計劃的57家篩查中心中，有11家使用GSP系統檢測，其臨界值為160～360 U/L。本研究采用間接法計算出的G6PD篩查臨界值為男嬰317.8 U/L、女嬰325.7 U/L。回顧性分析233例G6PD缺乏癥患兒和70份室間質量評價樣本，依據此篩查臨界值能檢出所有患兒，且室間質量評價陰性、陽性符合率均達100%。

傳統的直接法建立參考區間需要從健康人群中篩選出符合要求的參考個體，遺傳代謝病的患病率較低，計算相關指標臨界值至少需要10 000名新生兒，且隨著檢測數據的積累，需要不斷修正臨界值[14]，這對新生兒篩查實驗室的人力和物力是一個極大的考驗。另外，對在出生48 h就采集樣本的新生兒疾病篩查，很多疾病還未表現出來，難以保證全部為健康人群，這使得篩選參考個體變得異常困難。本實驗室早期采用直接法建立臨界值，入組的28例陽性樣本和75例陰性樣本均經基因檢測明確診斷，檢測成本高，入組數量有限，難以在臨床推廣[6]。因此，很多新生兒篩查實驗室直接引用試劑廠商或其他實驗室建立的參考區間，但因人群、地域和檢測系統的差異，會產生過多的假陽性和假陰性，甚至出現漏診，直接影響新生兒疾病篩查的效率。間接法[15]是利用實驗室數據庫中已有的數據，以數學統計模型為基礎建立參考區間的方法，既可以獲得與直接法近似的結果，也避免了直接法的繁瑣過程，在成本效益方面遠優于直接法。美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2010年發布的EP28-A3C文件[16]中允許實驗室通過間接法來建立參考區間。但將間接法用于新生兒疾病篩查項目參考區間的建立，同時建立篩查臨界值尚未見報道。本研究結果顯示，男嬰與女嬰之間G6PD水平差異有統計學意義（P＜0.000 1），采用間接法建立的篩查臨界值高于廠商聲明的參考區間下限及本實驗室依據小樣本建立的臨界值。這進一步說明每個新生兒篩查實驗室均應自行建立相關篩查項目的參考區間和篩查臨界值，且隨著篩查量的增加，臨界值需不斷修正。本研究基于133 580名新生兒的G6PD檢測數據，采用間接法建立的G6PD臨界值為：男嬰317.8 U/L、女嬰325.7 U/L。雖然會增加一定的假陽性率，但能避免漏診現象的發生。確診病例和第三方室間質量評價機構結果的回顧性分析均確認了該篩查臨界值用于臨床G6PD缺乏癥篩查的可行性。

綜上所述，新生兒疾病篩查信息系統中存儲著大量的檢測數據，基于現有的大樣本量數據，采用間接法建立G6PD的參考區間和篩查臨界值，可為提高新生兒G6PD缺乏癥的篩查效率提供一種切實、有效的方法，具有臨床推廣價值。