miR-30a-3p/OCT-1調控肝細胞癌的分子機制研究

賀松琴，陳瀟，李因茵，榮光華，葉映泉，聞炳基，羅家玉

目前，肝細胞癌（HCC）抗腫瘤藥物治療的主要策略是使用分子靶向藥物（MTAs），其中索拉非尼（Sorafenib）在臨床已得到廣泛應用，但患者普遍存在明顯耐藥及較嚴重的毒副反應[1]。目前全球各種新型的分子靶向藥物，如瑞戈非尼（Regorafenib）、侖伐替尼/樂伐替尼（Lenvatinib）以及卡博替尼（Cabozantinib）等均批準用于進展期HCC治療[2]。這些藥物與Sorafenib均有相同的化學機構母核{1-[4-（pyridin-4-yloxy）phenyl]urea}，臨床易出現與Sorafenib類似的耐藥現象或毒副反應。

轉錄因子OCT-1是Pit-Oct-Unc（POU）轉錄因子家族的重要成員，能夠通過與八聚體序列（AGTCAAAT）基序（motif）結合，介導其下游基因的轉錄，在包括HCC在內的惡性腫瘤細胞轉移與侵襲等重要生理過程中發揮了重要作用[3]。microRNA是一類由RNA聚合酶II（RNAPol II）轉錄的小分子非編碼RNA，能夠通過序列特異的方式作用于目標基因的3’非翻譯區（3’UTR）降解目的基因的mRNA，最終誘導特定基因的表達沉默[4]。因此，利用微小RNA（miR）的表達載體特異性沉默癌基因的表達是有效的抗腫瘤治療策略[5]。為此，本研究首先使用在線生物信息學工具預測可能作用于OCT-1的miR-30a-3p，再利用化學合成的方法構建pre-miR-30a-3p的慢病毒表達載體，在此基礎上制備包括pre-miR-30a-3p全序列的慢病毒，檢測miR-30a-3p對HCC細胞中OCT-1的影響以及對HCC細胞轉移與耐藥的調控作用。報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料與實驗設備（1）細胞株及細胞培養耗材：高侵襲性HCC細胞系MHCC97-H（中國醫學科學院中國協和醫科大學基礎醫學研究所細胞中心）；DMEM培養基、胎牛血清（FBS）等為美國Thermo公司產品；60及90 mm直徑細胞培養板，細胞培養瓶及6孔、96孔細胞培養板，均為美國Corning公司產品；預裝-預滅菌的移液器吸頭（包括1000-200、200-20以及1～20l量程）均為美國Axygen公司產品；Transwell培養板、小室為美國Corning公司產品；陽離子脂質體轉染試劑為美國Thermo公司產品。（2）試劑盒：RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒及定量PCR試劑盒等均為美國ABI公司產品；分子生物學使用的各類載體均購買自山東維真公司（Vigene）；載體構建實驗使用的各種工具酶類，包括限定性內切酶和DNA鏈接酶為英國NEB公司產品。（3）實驗動物：4～6周齡的胸腺缺失（T細胞缺失）的免疫缺陷小鼠購買自北京斯貝福公司，在SPF清潔條件下進行飼養；60Co-預照射滅菌的鼠糧、墊料等購買自軍事科學院軍事醫學研究院實驗動物中心；其余動物手術使用的各式器材，包括針持、縫合針、縫合線、粘鼠板、超凈手術工作臺等均為國產常規器材。細胞培養實驗使用的恒溫恒濕CO2細胞培養箱為Thermo公司產品；細胞觀察實驗使用的倒置相差顯微鏡為日本尼康公司產品；定量聚合酶鏈式反應（qPCR）實驗使用的實時熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品（ABI7500）；系列量程的移液器為德國Eppendorf公司產品；其余設備，包括臺式離心機、冰箱等均為國產常規設備；液相色譜-質譜聯用平臺為中國醫學科學院基礎醫學研究所公共實驗平臺保障與提供。

1.2 研究方法

1.2.1 miR預測與載體構建 查詢可知OCT1的Gene Symbol為POU2F1，使用在線工具miRDB對作用于POU2F1的miRs進行預測，結合預測評分和人工判讀即選取評分最高的miR：miR-30a-3p為OCT-1的調控分子。在此基礎上在NCBI數據庫中檢索得到hsa-pre-miR-30a-3p的全序列，通過化學合成的方法獲得包含有半酶切位點的miR-30a-3p的正義與反義序列，二者使用PCR以獲得雙鏈DNA片段。在此基礎上依據has-pre-miR-30a-3p的半酶切位點對慢病毒載體（pLV）進行酶切后與所獲得的miR-30a-3p進行連接，最終獲得miR-30a-3p的慢病毒載體并包裝獲得miR-30a-3p的慢病毒顆粒；將包含有野生型的OCT-1全序列或突變的miR-30a-3p作用位點的OCT-1全序列克隆至pLV載體上，再包裝為慢病毒顆粒。

1.2.2 定量PCR實驗 依據Liang等[6]方法實驗，在MHCC97-H細胞中分別轉染對照組、miR-30a-3p以及miR-30a-3p+OCT-1Mut后，收集MHCC97-H細胞提取總RNA樣品，對樣品進行逆轉錄并進行qPCR檢測。以目標基因相對于內參基因（-Actin）的表達水平計算相對表達水平。（1）OCT-1正向引物5’-GAAACGCACCAGCATAGAGACC-3’，反向引物

5’-GGCGGTTACAGAACCAAACACG-3’；（2）Cyclin D1（ccnd1）正向引物5’-TCTACACCGACAA CTCCATCCG-3’，反向引物5’-TCTGGCATTTTGGAGAGGAAGTG-3’；（3）abcb1正向引物5’-GCTGTCAAGGAAGCCAATGCCT-3’，反向引物5’-TGCAATGGCGATCCTCTGCTTC-3’；（4）abcg2正向引物5’-GTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTT-3’，反向引物5’-TCCTCCAGA CACACCACGGATA-3’；（5）snail正 向 引 物 5’-TCAGACGAGGACAGTGGGAAAG-3’，反向引物5’-GCTTGTGGAGCAGGGACATTC-3’；（6）twist正 向 引 物5’-GTACATCGACTTC CTCTACCAG-3’，反向引物5’-CATCCTCCAGACCGAGAAG-3’；（7）內參-actin正向引物5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’，反向引物5’-AGGTCTTTGCGGAT GTCCACGT-3’。

1.2.3 Transwell實驗 依據Fan等[4]方法實驗，在MHCC97-H細胞中轉染相應載體（control miRNA或miR-30a-3p）后，再使用不含有血清的DMEM培養基收集細胞并重懸細胞制備為細胞懸液，再將制備所得的細胞懸液細胞接種于Transwell板的小室中（每孔接種約20 000個細胞）。在這一過程中（即Transwell實驗），對于轉移實驗，細胞懸液直接接種在Transwell板的小室中；對于侵襲實驗，首先在小室中預鋪一層ECM膠模擬組織的基底膜，再將MHCC97-H細胞懸液接種在小室中。此后，在Transwell板外室（即24孔板）中加入含有10%FBS的DMEM后孵育小室（即將前述添加有細胞懸液的Transwell細胞小室放入到24孔板中，使小室底部浸潤在24孔板內容納的包含有10%FBS的DMEM中；侵襲實驗在37℃孵育14～16 h；轉移實驗在37℃孵育6～8 h），此后以結晶紫試劑（0.5%w/v）對單克隆進行染色。

1.2.4 細胞單集落形成實驗 依據Feng等[7]方法實驗，在MHCC97-H細胞中轉染相應載體（control miRNA或miR-30a-3p）后收集細胞，將細胞接種于6孔細胞培養板中。經過3～4周的生長，MHCC97-H細胞能夠形成單克隆，此時使用結晶紫試劑（0.5%w/v）對單克隆進行染色，使用Image J軟件對單克隆的照片進行定量分析，依據克隆總面積相對于6孔板孔的總面積確定各組克隆的數量，再依據對照組為單位1計算相對克隆數量。

1.2.5 MTT實驗 依據Chen等[8]方法實驗，MHCC97-H細胞中轉染相應載體（control miRNA或miR-30a-3p）后再收集細胞，使用系列劑量的分子靶向藥物處理細胞約48 h，此后細胞中添加50 mmol/L的MTT試劑，孵育4～6 h后棄去培養基以10%SDS裂解細胞裂解液在490 nm處讀取吸光度值，依據O.D.490 nm計算藥物作用的抑制率，并依據抑制率計算藥物作用的半數抑制率（IC50值）。

1.2.6 藥物代謝與清除檢測實驗 依據Feng等[9]方法實驗，MHCC97-H細胞中轉染相應載體（control miRNA或miR-30a-3p）后再以1mol/L劑量的Sorafenib處理細胞約12 h，此后棄去培養基上清換成正常DMEM培養基，在系列時間點（0、4、8、12、24、48及72 h時點）收集細胞樣品進行超聲破碎，再使用有機溶劑（乙腈）將細胞樣品中的Sorafenib萃取出來，再使用液相色譜、質譜聯用技術檢測系列時間點細胞樣品中Sorafenib的含量并計算藥物在MHCC97-H細胞中的半衰期。

1.3 統計分析 數據采用SPSS 9.0軟件分析，計量資料采用Bonferroni校正行方差分析，使用Origin統計分析軟件確定藥物作用于細胞的半數作用濃度（IC50 values）或藥物在細胞中的存留的半衰期。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-30a-3p作用于OCT-1的3’UTR抑制其表達 在OCT-1的3’UTR區域存在兩個miR-30a-3p的作用位點；miR-30a-3p能夠下調MHCC97-H細胞中OCT-1的mRNA表達水平；miR-30a-3p不能夠抑制3’UTR區域中miR-30a-3p作用位點突變的OCT-1，此時在MHCC97-H細胞中轉染OCT-1突變體，能夠恢復細胞中OCT-1的表達。見封二彩圖1。

圖1 miR-30a-3p作用于OCT-13’UTR的位點序列信息

miR-30a-3p能夠下調OCT-1下游基因的表達水平，其中包括：（1）下調細胞增殖相關基因Cyclin D1表達（P＜0.05）；（2）下調細胞轉移與侵襲相關基因Snail和Twist（均P＜0.05）；（3）下調細胞耐藥相關基因ABCB1/MDR-1以及ABCG2/BRCP等（均P＜0.05）。見圖1。

圖1 miR-30-3p下調OCT-1及其下游基因的表達水平

2.2 miR-30a-3p作用于OCT-1的3’UTR抑制MHCC97-H細胞的轉移與侵襲 在MHCC97-H細胞中轉染miR-30a-3p能夠抑制MHCC97-H細胞的體外轉移與侵襲作用，同時在MHCC97-H細胞中轉染miR-30a-3p的同時轉染OCT-1的突變體則能夠抑制miR-30a-3p的作用。見封二彩圖2a～b。

圖2 miR-30a-3p抑制MHCC97-H細胞的轉移與侵襲作用

MHCC97-H細胞能夠突破裸鼠肝包膜進而侵襲進入裸鼠肝臟。在MHCC97-H細胞中轉染miR-30a-3p能夠抑制MHCC97-H細胞在裸鼠肝臟臟器的侵襲作用，而在MHCC97-H細胞中同時轉染OCT-1突變體則能夠抑制miR-30a-3p對于MHCC97-H細胞在裸鼠肝臟原位侵襲作用的抗腫瘤活性。見封二彩圖2a、c。

2.3 miR-30a-3p作用于OCT-1的3’UTR上調MHCC97-H細胞對分子靶向藥Sorafenib的敏感性

在MHCC97-H細胞中轉染miR-30a-3p能夠顯著延緩Sorafenib在MHCC97-H細胞中的代謝與清除作用，Sorafenib的半衰期顯著延長：對照組為（25.31±7.99）h，miR-30a-3p組為（43.02±6.67）h。而在MHCC97-H細胞中轉染OCT-1突變體則能夠抑制miR-30a-3p的作用：miR-30a-3p+OCT-1Mut組Sorafenib的半衰期為（20.55±10.75）h。

圖3 miR-30a-3p能夠上調Sorafenib對MHCC97-H細胞的殺傷作用

3 討論

受診療技術的限制，HCC患者往往初診即為進展期。由于進展期HCC具有對傳統細胞毒性化療藥物多藥耐藥的特性，因此常見化療藥物如阿霉素等在HCC治療中少有應用，僅能夠應用于經肝動脈化療栓塞（TACE）等少數特殊治療策略。因此分子靶向治療在HCC治療中具有重要意義。盡管有大量臨床試驗進行了相關研究，但仍然僅有Sorafenib等4種分子靶向藥物最終獲批上市用于進展期HCC患者治療，這些藥物的作用機制類似，都是作用于VEGFR、PDGFR以及Raf等受體酪氨酸蛋白激酶蛋白以及下游MAPK等信號通路最終抑制HCC細胞的增殖、轉移、侵襲以及腫瘤血管生成作用[10]。其他藥物，包括曲妥珠單抗等都沒能通過臨床試驗。研究和開發新的治療和干預靶標成為現階段亟需解決的問題。

本研究闡明了miR-30a-3p/OCT-1在HCC中的作用，發現在HCC細胞中過表達miR-30a-3p具有良好的抗腫瘤作用。作為重要的腫瘤促進因子，OCT-1能夠作為轉錄因子介導多種下游基因的轉錄，這些因子主要是細胞轉移與侵襲相關因子，也包括部分耐藥相關因子。這使得OCT-1是HCC治療的理想干預靶點：抑制OCT-1的活性或下調其表達水平既能夠直接抑制HCC的增殖、轉移與侵襲作用，同時也能夠促進HCC細胞對其他抗腫瘤藥物的敏感性。