百香果莖基腐病病原菌鑒定及其生物學特性

黃艷花，寧 平，黃遠光，歐善生，張燕杏，覃潮妮，蒙 成

(1. 廣西農業職業技術大學，南寧 530007；2.廣西梧州市長洲區倒水鎮農業技術推廣站，廣西 梧州 543006)

【研究意義】百香果(PassifloraedulisSims)學名西番蓮，為西番蓮科西番蓮屬熱帶、亞熱帶多年生常綠藤本漿果類果樹，具有很高的營養價值和藥用價值[1-2]。近年來，隨著百香果種植年限的延長和規模的不斷擴大，百香果莖基腐病也在逐年蔓延，個別果園發病率、死亡率達80%～90%，造成果園缺株嚴重、園相零亂、掛果面少、產量低[3]。筆者于2020年4—8月深入廣西5個生態區10個百香果種植基地開展田間調查，發現該病發病率較重，部分一年生果園發病率在30%以上，連作果園病株死亡率達50%～60%，多地已出現因該病蔓延而導致荒廢的果園。百香果莖基腐病的病原菌研究目前雖有相關報道，但研究結果不一致，不同地區病原菌種類存在差異。因此，鑒定百香果莖基腐病病原菌及分析其生物學特性，對百香果莖基腐病的科學防控及廣西百香果產業持續快速發展具有重要意義。【前人研究進展】近年來，我國已有不少研究人員開展百香果莖基腐病病原菌鑒定研究，但研究結果不盡相同。黃盈等[4]、陳星等[5]分別進行福建和廣西防城港西番蓮莖基腐病病原菌鑒定，并確定該病原菌為尖孢鐮孢菌(FusariumoxysporumSchlecht)。李德福等[6]將福建、宋曉兵等[7]將廣東的西番蓮莖基腐病病原菌鑒定為腐皮鐮孢菌[F.solani(Mart) Sacc]。詹儒林等[8]將海南瓊海西番蓮莖基腐病病原菌鑒定為煙草疫霉菌(PhytophthoranicotianaeBreda de Haan)。邱金忠[9]研究認為，百香果莖基腐病病原菌單獨或與多種病原菌聯合侵染導致植株莖基部和根部腐爛，其中鐮刀菌(Fusarium)和腐霉菌(Pythium)為主要病原菌。林泗海等[10]、黎靜[11]研究發現，百香果莖基腐病的病原菌為茄鐮刀菌。在發病規律研究方面，林泗海等[10]調查發現，百香果莖基腐病在3—12月均可發生為害，發病高峰期在5—7月，該時期的高溫高濕為病菌繁殖提供了有利氣候條件。李德富等[12]調查認為，高溫、高濕季節加上不良環境條件、不適栽培管理措施及種植感病品種是百香果莖基腐病發生的主要因素。黃志巧等[13]研究發現，65%代森鋅和80%多菌靈對西番蓮莖基腐病防控均具有顯著效果；林泗海等[10]研究表明，于百香果莖基腐病發病高峰期，在植株根頸部涂抹或淋施70%甲基托布津可濕性粉劑500倍液，每10～15 d防治1次，連續防治3次，可有效預防和控制百香果莖基腐病的發生和蔓延為害；黎靜[11]研究提出，百香果莖基腐病的綜合防治技術包括正確選擇種植地、進行科學化管理、科學選擇種植品種、及時清理病死植株和及時進行藥劑防治等。【本研究切入點】至今，在廣西不同生態區開展百香果莖基腐病病原菌及生物學特性鑒定研究鮮見報道，對引致百香果莖基腐病的主要病原菌仍未明確。【擬解決的關鍵問題】通過百香果莖基腐病病原菌分離、形態特征觀察、致病性測定和rDNA-ITS序列分析，對百香果莖基腐病病原菌及其生物學特性進行鑒定，以明確引致百香果莖基腐病的病原菌及其生物學特性，為百香果莖基腐病的科學防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年4—8月在廣西農業職業技術大學進行。于廣西百香果莖基腐病發生高峰期，分別從廣西梧州市、來賓市、上林縣、都安縣和南寧市郊區等百香果種植基地采集癥狀典型、病斑新鮮的臺農1號百香果莖基腐病病株帶回實驗室，用于病原菌分離。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離與純化 采用植物病原真菌常規分離法進行病原菌分離[14]。切取百香果病株莖基部病健交界處的組織塊，經75%酒精消毒1 min、5%次氯酸鈉消毒3 min、無菌水漂洗4次后接種至PDA培養基，置于28 ℃恒溫培養，培養1～2 d長出菌絲后，挑取菌落邊緣接種至PDA培養基進行純化，獲得的純培養物保存于PDA斜面培養基上，4 ℃保存備用。

1.2.2 病原菌致病性測定 莖節離體接種：將純化保存的病原菌活化后接種至PDA培養基上28 ℃培養3 d，用直徑6 mm的打孔器打取菌絲塊。剪取長勢一致的健康百香果莖節，先用無菌水清洗干凈，75%酒精浸泡2 min濾干，待表面殘留的水分干后，用一次性醫用針頭輕扎3個距離小于1 cm孔，然后挑取制備好的菌絲塊置于刺傷部位，帶菌絲的面接觸枝條，置于鋪有3層紗布保濕的瓷盆，用保鮮膜密封后28 ℃恒溫培養。接種發病后從病斑上再次分離病原菌。

植株活體接種：分別選擇在苗圃扦插培育的3月齡健康小杯苗及6月齡健康盆栽苗(品種均為紫香)，將純化保存的病原菌活化后接種至PDA培養基上28 ℃培養3 d，用一次性醫用針頭刺傷莖基部的表皮數處，以直徑6 mm的打孔器打取菌絲塊接種至傷口處，用醫用脫脂棉浸泡無菌水后纏繞接種部位，外包保鮮膜保濕，接種后每天淋水保濕7 d。設3次重復，每重復接種5株植株，以不帶菌的PDA培養基塊為對照組，待發病后重新分離病原物，進行柯赫氏法則驗證。

1.2.3 病原菌鑒定 形態學鑒定：將直徑5 mm的菌絲塊接種在PDA培養基上，置于28 ℃光照培養箱恒溫培養，觀察、描述菌落顏色和形態，定期觀察菌落生長情況，在光學顯微鏡下觀察病原菌的菌絲和孢子形態，查閱真菌分類鑒定工具書，初步確定病原菌分類地位。

分子生物學檢測：提取病原菌基因組DNA、PCR擴增、測序及比對委托廣西南寧國拓生物科技有限公司完成。病原菌DNA采用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取，采用真菌生物核糖體DNA通用引物ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′對rDNA-ITS區域進行PCR擴增。PCR反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 15 s，56 ℃15 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環；72 ℃延伸5 min。將測序及拼接結果在NCBI中進行BLAST比對，用DNA序列檢索其匹配序列，進行同源性比較。以近緣菌株構建系統發育進化樹，確定病原菌的分類地位。

1.2.4 病原菌生物學特性觀測 溫度、光照和pH對菌絲生長的影響：參考朱迎迎等[15]的方法，將病原菌接種于PDA培養基上，分別置于5、10、15、20、25、28、30、35和40 ℃培養箱培養40 h，以十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長量；將病原菌接種于PDA培養基上，進行全黑暗(0 lx)、半光半暗(200 lx 12 h/0 lx 12 h)和全光照(200 lx)3種光照環境處理，全黑暗處理使用4層錫箔紙包裹遮光，置于30 ℃恒溫培養40 h，測定菌落直徑；用鹽酸和氫氧化鈉溶液將PDA培養基的pH分別調配為3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00和11.00，將病原菌接種其上，置于30 ℃恒溫培養40 h，測定菌落直徑。每處理均為4次重復。

培養基對菌絲生長的影響：參考梁萍等[16]的方法并略加修改，制備PDA培養基(馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂20.0 g、水1000.0 mL)、Czapek培養基(硝酸鈉3.0 g、磷酸氫二鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30.0 g、瓊脂20.0 g、水1000.0 mL)、OA培養基(燕麥片30.0 g、瓊脂20.0 g、水1000.0 mL)、CMA培養基(玉米粉30.0 g、瓊脂20.0 g、水1000.0 mL)、汁液培養基(健康新鮮百香果枝葉200.0 g，水熬煮30 min，瓊脂20.0 g，水1000.0 mL)和WA培養基(瓊脂15.0 g，補足水至1000.0 mL)。上述6種培養基的pH自然。將病原菌分別接種于上述培養基上，置于30 ℃恒溫培養40 h，測定菌落直徑。每處理4次重復。

碳和氮源對菌絲生長的影響：參考胡美姣等[17]的方法并略加修改，以Czapek培養基為基礎培養基(硝酸鈉3.0 g、磷酸氫二鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30.0 g、瓊脂20.0 g、水1000.0 mL)，分別用等質量的麥芽糖、乳糖、葡萄糖、D-果糖、D-木糖、木糖醇、甘露醇、山梨醇、甘油和淀粉置換蔗糖，配制成10種含不同碳源的培養基；用等質量的L-精氨酸、DL-丙氨酸、L-賴氨酸、甘氨酸、氯化銨、磷酸二氫銨、牛肉膏、酵母粉、蛋白胨和尿素置換硝酸鈉，配制成10種氮源的培養基，并設無碳源、無氮源培養基為對照。挑取直徑為6 mm的菌餅接種至上述不同碳、氮源培養基平板中央，置于30 ℃恒溫暗培養40 h，采用十字交叉法同時測定各處理的菌落直徑。每處理4次重復。

致死溫度測定：預備試驗取菌餅置于含5.0 mL滅菌水的離心管中，分別于40、45、50、55、60和65 ℃恒溫水浴10 min，取出菌餅置于PDA培養基上30 ℃倒置培養2 d，觀察有無菌絲生長。按相差1 ℃再試驗，最終確定致死溫度。

1.3 統計分析

試驗數據采用Excel 2010進行整理，以Duncan’s新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 百香果莖基腐病病害癥狀及發病情況

受莖基腐病病原菌為害的百香果植株初期莖基部皮層呈暗黑色、水漬狀、腐爛，后逐漸擴展至韌皮部和木質部，病部組織易與木質部分離，剝開皮層后木質部也有濕腐現象。為害輕時植株仍能正常生長，當形成腐爛圈時，葉片失水萎蔫，此時葉片仍為綠色，根系完好，最后病斑逐步在莖部向上、向下擴展，導致整株植株莖枝褐色干腐，萎蔫死亡。在病部看到明顯的黑色小顆粒即為病原菌分生孢子器。

2.2 百香果莖基腐病病原菌致病性測定結果

在實驗室對采自廣西各百香果種植基地的典型百香果莖基腐病癥狀植株病部進行分離，均分離到同一形態真菌，命名為32-WUB3菌株。菌株離體接種致病性測定結果(圖1-A，1-C)顯示，接種1 d后，百香果接種部位開始出現水漬狀病斑，隨后病斑沿莖部呈條形擴展，最后整條枝條腐爛，而對照百香果枝條的莖節無發病癥狀；發病后從病斑上再次分離獲得與接種病原菌相同的菌株；菌株活體3月齡小杯苗和盆栽6月齡大苗接種致病性測定結果(圖1-D～G)顯示，接種3 d后，接種部位開始出現暗黑色、水漬狀腐爛，接種5～7 d植株葉片失水萎蔫，10～15 d后整株萎蔫枯死，在病部看到明顯的黑色小顆粒即為病原菌分生孢子器，而對照組植株健康，無感病癥狀出現(圖1-H)；植株發病后從病斑上再次分離獲得的病原菌其菌落形態及菌體特征與接種病原菌完全一致。

2.3 百香果莖基腐病病原菌的形態特征及分類地位

2.3.1 形態學特征 32-WUB3菌株在PDA培養基上于28 ℃條件下培養，菌絲生長迅速，36～48 h可鋪滿整個培養皿(d=90.00 mm)，初期生長稀疏，呈白色至灰白色，氣生菌絲發達呈放射狀，菌落圓形或近圓形，邊緣整齊，背面白色(圖2-A)，后期菌絲逐漸變為灰黑色至黑色，背面黑色(圖2-B)，有時呈束狀直立生長(圖2-C)；在PDA培養基上產孢極少，在OA培養基(圖2-D)、田間和回接病原菌的發病植株(圖1-G)上肉眼可見黑色粒狀小點，在顯微鏡下可見分生孢子器；分生孢子器近球形或不規則形，黑色，分生孢子橢圓形或卵形，初期單胞無色，老熟后呈褐色，近中部有一個橫隔膜(圖2-E，2-F)，其大小為(21.28～28.50)μm×(12.30～16.10)μm，平均為25.23 μm×14.01 μm。根據菌落及分生孢子形態學特征，參考現有的文獻[21]初步將32-WUB3菌株鑒定為子囊菌門座囊菌綱葡萄座腔菌目葡萄座腔菌科毛色二孢屬(Lasiodiplodia)。

2.3.2 分子生物學鑒定結果 對32-WUB3菌株進行PCR擴增，采用雙向測序并進行拼接，將病菌的rDNA-ITS序列測序結果在NCBI中進行BLAST比對，結果發現所測序列與可可毛色二孢菌(L.theobromae)相關序列的相似性達99%。查找相似物種的同一基因序列，使用MEGA 6.0對相似性較高的菌株及同屬不同種菌株進行聚類，構建系統發育進化樹，結果(圖3)表明，32-WUB3菌株與L.theobromaeIRNBS73(MN634044.1)菌株聚在同一分枝上，進一步證實可可毛色二孢菌是百香果莖基腐病的病原菌。

2.4 百香果莖基腐病病原菌的生物學特性

2.4.1 不同溫度、光照和pH下的菌絲生長特性 從圖4可看出，菌絲在10～35 ℃均可生長，在10～28 ℃的生長速度隨著溫度的升高而提高，在28～35 ℃的生長速度隨著溫度的升高而降低，低于10 ℃和高于35 ℃時菌絲生長均受到嚴重抑制，溫度為5和40 ℃時菌絲不生長。其中，菌絲在28和30 ℃時生長較快，菌落直徑分別為8.27和8.31 cm，二者差異不顯著(P>0.05，下同)，但均極顯著高于其他溫度條件下的菌落直徑(P<0.01，下同)；在25 ℃條件下菌絲生長也較快，其菌落直徑極顯著高于除28和30 ℃條件外其他溫度條件下的菌落直徑。說明32-WUB3菌株的菌絲生長最佳溫度為28～30 ℃。

圖3 基于rDNA-ITS序列構建的32-WUB3菌株系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 32-WUB3 strain constructed based on rDNA-ITS sequence

從圖5可看出，32-WUB3菌株對光照條件敏感，其中，在全光照條件下生長最快，菌落直徑達8.49 cm，極顯著高于全黑暗條件下的菌落直徑，顯著高于半光半暗條件下的菌落直徑(P<0.05，下同)；在半光半暗條件下的菌落直徑為8.13 cm，顯著高于全黑暗條件下的菌落直徑；在全黑暗條件下生長最慢，菌落直徑僅6.97 cm。說明全光照是最適宜32-WUB3菌株菌絲生長的光照條件。

從圖6可看出，32-WUB3菌株對pH的適應范圍較廣，其中，在pH 3.00～11.00時菌絲均可生長，在pH 3.00～8.00時菌絲生長較快，菌落直徑達8.10～8.44 cm，各pH處理間差異不顯著，但均顯著或極顯著高于pH 9.00～11.00處理的菌落直徑；pH 9.00和pH 10.00條件下的菌落直徑分別為7.17和7.09 cm，二者間無顯著差異，但均極顯著高于pH 11.00時的菌落直徑(2.83 cm)。說明最適宜32-WUB3菌株菌絲生長的pH為3.00～8.00。

圖4 不同溫度對32-WUB3菌株菌絲生長的影響Fig.4 Effects of different temperature on mycelial growth of 32-WUB3 strain

圖5 光照條件對32-WUB3菌株菌絲生長的影響Fig.5 Effects of light condition on mycelial growth of 32-WUB3 strain

2.4.2 菌絲在不同培養基中的生長特性 從圖7可看出，32-WUB3菌株在6種培養基中均能生長，其中，在PDA培養基中生長最快，菌落直徑達9.00 cm，極顯著高于其他培養基的菌落直徑；其次為OA培養基，其菌落直徑極顯著高于除PDA培養基外的其他培養基；在CMA培養基中菌絲生長最慢，其菌落直徑均極顯著小于其他培養基。說明PDA培養基是最適宜32-WUB3菌株菌絲生長的培養基。

2.4.3 菌絲在不同碳和氮源中的生長特性 從圖8可看出，32-WUB3菌株在10種碳源上均可生長，但菌絲生長速度在不同碳源間存在差異。其中，以葡萄糖為碳源時菌絲生長最快，菌落直徑達7.78 cm，顯著高于其他碳源的菌落直徑；菌絲生長較快的碳源依次有D-果糖、甘油和山梨醇，其菌絲生長狀況較佳，菌落直徑在4.98～6.39 cm，相互間無顯著差異；以D-木糖、乳糖、木糖醇和麥芽糖為碳源時

圖6 不同pH對32-WUB3菌株菌絲生長的影響Fig.6 Effects of different pH on mycelial growth of 32-WUB3 strain

圖7 不同培養基對32-WUB3菌株菌絲生長的影響Fig.7 Effects of different medium on mycelial growth of 32-WUB3 strain

圖8 不同碳源對32-WUB3菌株菌絲生長的影響Fig.8 Effects of different carbon source on mycelial growth of 32-WUB3 strain

菌絲生長較慢，菌落直徑均低于4.60 cm，相互間無顯著差異，但均與以D-果糖、甘油和山梨醇為碳源的菌落直徑存在顯著或極顯著差異。說明葡萄糖是最適宜32-WUB3菌株菌絲生長的碳源。

從圖9可看出，菌株32-WUB3在10種氮源上均可生長，但菌絲在不同氮源上的生長速度存在差異。其中，菌絲在以酵母粉、蛋白胨、DL-丙氨酸、L-精氨酸和甘氨酸為氮源時菌落生長較快，菌落直徑均高于6.00 cm(尤其以酵母粉為氮源的菌落直徑達7.13 cm)，且相互間無顯著差異，但均顯著或極顯著高于以牛肉膏為氮源的菌落直徑，極顯著高于以尿素、磷酸二氫銨、氯化銨、L-賴氨酸和CK為氮源的菌落直徑；在以牛肉膏為氮源時菌絲生長也較好，菌落直徑為5.13 cm，顯著高于以尿素、磷酸二氫銨、氯化銨、L-賴氨酸和CK為氮源的菌落直徑；在以尿素、磷酸二氫銨、氯化銨、L-賴氨酸和CK為氮源時菌絲生長較慢，菌落直徑均小于3.50 cm，且相互間無顯著差異。說明酵母粉是最適宜32-WUB3菌株菌絲生長的氮源，其次為蛋白胨、DL-丙氨酸、L-精氨酸和甘氨酸。

2.4.4 病原菌的致死溫度測定結果 菌株32-WUB3的病原菌分別經40、45和50 ℃處理10 min仍能在PDA培養基上生長，而在55 ℃及以上溫度時不能生長。再以50、51、52、53和54 ℃進行測試，結果發現在52、53和54 ℃時培養皿中未見長出菌絲。因此，確定該病原菌的致死條件為52 ℃處理10 min。

3 討 論

本研究對采自廣西不同生態區百香果種植基地的百香果莖基腐病病株的病菌進行形態特征觀察、致病性測定和分子鑒定等，首次發現可可毛色二孢菌是百香果莖基腐病的病原菌。該病原菌主要為害百香果成株期莖基部，嚴重時從莖基部向莖稈上部擴展蔓延；人工接種可侵染百香果苗莖基部，導致百香果苗整株葉片在短期內失水萎蔫、下垂，莖基部皮層呈暗黑色、水漬狀腐爛，后逐漸擴展至韌皮部和木質部，最后病斑逐漸從莖部向上擴展，導致整株植株莖枝褐色干腐，最后整株徹底枯死。可可毛色二孢菌是一種重要的植物病原菌，可導致熱帶、亞熱帶地區植物發生病害，包括茶樹、橡膠樹、獼猴桃和春芋葉斑病[18-21]，桉樹、白木香、肉桂枝枯病[22-24]、南洋楹潰瘍病[25]、欒樹裂皮病[26]和毛葡萄穗軸褐腐病[27]，造成巨大經濟損失。

圖9 不同氮源對32-WUB3菌株菌絲生長的影響Fig.9 Effects of different nitrogen sources on mycelial growth of 32-WUB3 strain

本研究結果表明，百香果可可毛色二孢莖基腐病病原菌喜高溫不喜低溫，溫度低于10 ℃難以生長，在35 ℃時仍然生長良好，最適宜生長溫度為28～30 ℃，與戴利銘等[19]報道的橡膠樹葉斑病可可毛色二孢菌相似，與該病易在5—7月大發生的發病規律[10]相符，說明該菌是一種高溫適生菌，容易造成百香果發病急、發病重，防治難度大，因此，生產上應采取預防為主、綜合防治的防控措施；該菌生長的pH范圍與薛振南等[24]的報道相似，適宜生長的pH范圍較廣，pH為3.00～8.00時均能良好生長，土壤和雨水的pH均不會阻礙其侵染和傳播；該病菌菌絲生長的最適合光照條件為全光照，在半光半暗條件下也能生長良好，全黑暗環境不利于其病原菌侵染，與石金巧等[20]報道的獼猴桃葉斑病致病病原菌可可毛色二孢菌最適光照條件一致；可可毛色二孢莖基腐病病原菌對營養要求不高，很多能培養真菌的培養基和碳、氮源均能滿足其生長需求，其中，菌絲生長的最適培養基為PDA培養基，最適碳源為葡萄糖，與戴利銘等[19]報道的橡膠樹葉斑病可可毛色二孢菌相似，其次為D-果糖、甘油和山梨醇，以D-木糖、乳糖、木糖醇和麥芽糖為碳源時，菌絲生長較緩慢；最適氮源為酵母粉，與石金巧等[20]對獼猴桃葉斑病致病病原菌可可毛色二孢菌的研究結果一致，其次是蛋白胨、DL-丙氨酸、L-精氨酸和甘氨酸，以尿素、磷酸二氫銨、氯化銨和L-賴氨酸為氮源時菌絲生長較緩慢；百香果可可毛色二孢莖基腐病病原菌菌絲致死溫度條件為52 ℃處理10 min，與戴利銘等[19]報道的橡膠樹葉斑病可可毛色二孢菌相似。

本研究明確可可毛色二孢菌為百香果莖基腐病的病原菌，并對其生物學特性進行了探究，但可可毛色二孢菌在百香果上的發生規律和防治技術還需進一步觀察分析。

4 結 論

可可毛色二孢菌是百香果莖基腐病的病原菌，適宜其菌絲生長的溫度為28～30 ℃，pH為3.00～8.00，光照條件為全光照，最佳培養基為PDA，最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為酵母粉，其致死條件為52 ℃處理10 min。