河蟹對(duì)水稻不同生育期根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

宋 宇,楊清海,曲貴偉

(遼東學(xué)院，遼寧 丹東 118003)

【研究意義】根際是指距離植物根系幾毫米寬的狹窄土壤區(qū)域，內(nèi)含細(xì)菌、真菌、古生菌等種類(lèi)眾多的微生物及腐殖質(zhì)等，植物根系分泌物可為根際微生物提供生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；根際微生物能促進(jìn)土壤中有機(jī)物質(zhì)的分解,同時(shí)使土壤中的碳、氮、磷、硫等元素參與到農(nóng)作物的物質(zhì)循環(huán)中并能抑制或減輕作物病害、逆境危害等，從而促進(jìn)農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育和提高農(nóng)作物的產(chǎn)量[1-2]。水稻是我國(guó)最重要的糧食作物，過(guò)去幾十年中，由于引進(jìn)高產(chǎn)品種、人為灌溉、大量使用化肥和農(nóng)藥，水稻產(chǎn)量有所增加[3-4]。但化肥和農(nóng)藥的過(guò)量使用會(huì)導(dǎo)致土壤酸化板結(jié)、溫室氣體排放增加、水體富養(yǎng)化等一系列生態(tài)環(huán)境問(wèn)題[5-7]。如今，將農(nóng)作物和動(dòng)物生產(chǎn)有效結(jié)合的復(fù)合種養(yǎng)模式受到人們廣泛關(guān)注。該模式不僅能提高養(yǎng)分循環(huán)效率而且能改善土壤生態(tài)環(huán)境[22]。研究表明，土壤微生物是維護(hù)稻田土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要成員，水稻在不同生育期的生長(zhǎng)過(guò)程實(shí)質(zhì)是土壤—微生物—水稻相互作用的過(guò)程[8-9]。水稻及其根系的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)可改變土壤理化性質(zhì)，土壤性質(zhì)又可影響水稻及其根系的生長(zhǎng)代謝，兩者的相互作用可調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的變化[10]。但河蟹對(duì)生物有機(jī)肥稻田不同生育期根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)影響的研究還屬少見(jiàn)。【前人研究進(jìn)展】土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究已由最初的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法逐步發(fā)展到可高效、準(zhǔn)確、快速獲取大量土壤微生物信息的高通量測(cè)序法。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)常規(guī)種植的水稻的根際微生物群落的研究取得了一定進(jìn)展[11]，目前已可全面分析菌群組成及群落結(jié)構(gòu)的變化。【本研究切入點(diǎn)】本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)開(kāi)展河蟹引入生物有機(jī)肥稻田后對(duì)不同生育期水稻的根際土壤細(xì)菌群落多樣性、豐度和群落結(jié)構(gòu)影響的研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探討河蟹引入生物有機(jī)肥稻田后不同生育期水稻的根際土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)、群落結(jié)構(gòu)變化及門(mén)水平的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群、相對(duì)豐度及和土壤理化因子的冗余(RDA)分析，揭示水稻不同生育期土壤微生物動(dòng)態(tài)變化及其影響因素，為探究復(fù)合種養(yǎng)模式水稻增產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集和處理方法

本試驗(yàn)選取越光大米為試驗(yàn)材料，試驗(yàn)在丹東東港市北井子鎮(zhèn)蓋家壩農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行，供試稻田為生物有機(jī)肥稻田和河蟹生物有機(jī)肥復(fù)合種養(yǎng)稻田，分別于水稻的分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期和成熟期在稻田上隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)采用破壞性取樣法將水稻整株挖出，勿傷害根系，抖落大塊土壤后用無(wú)菌刷取根際區(qū)域約5 mm緊密粘附在根表面的土壤，每5株為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)時(shí)期3次重復(fù)。混合后的樣品分成2份，1份裝入密封袋，帶回風(fēng)干處理，用于理化指標(biāo)分析；1份裝入50 mL離心管中，-80 ℃冷凍保存，用于微生物多樣性分析。生物有機(jī)肥稻田的分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期和成熟期分別用YJTFN、YJTBJ、YJTCHS和YJTCS表示，河蟹有機(jī)肥稻田的4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期則分別用HXTFN、HXTBJ、HXTCHS和HXTCS表示。

1.2 土壤理化因子的測(cè)定

土壤pH值采用酸度計(jì)法測(cè)定；有機(jī)質(zhì)測(cè)定采用重鉻酸鉀氧化—分光光度法；速效鉀測(cè)定采用氯化鈣浸提—火焰光度計(jì)法；速效磷測(cè)定采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法；全氮測(cè)定采用凱氏定氮法[12]。

兩極化——中大型軟件平臺(tái)向行業(yè)化應(yīng)用垂直深入，整合的功能和業(yè)務(wù)越來(lái)越豐富；中小型軟件平臺(tái)向輕量化應(yīng)用演變，界面功能和交互操作越來(lái)越簡(jiǎn)捷。這兩個(gè)看似矛盾的方向，根本上是為解決不同用戶的需求，本質(zhì)上都是依托先進(jìn)強(qiáng)大的底層架構(gòu)。

1.3 土壤微生物DNA提取、擴(kuò)增及測(cè)序

利用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒進(jìn)行土壤微生物基因組DNA提取，提取的DNA經(jīng)適當(dāng)稀釋后在-20 ℃條件下保存用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。用通用引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)，并利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)委托上海美吉生物對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

如表3所示，Shannon、Ace和Chao 3種α多樣性指數(shù)分析顯示生物有機(jī)肥田成熟期的Shannon和Chao指數(shù)均高于前3個(gè)時(shí)期且差異顯著(P<0.05)。成熟期的Ace指數(shù)雖高于前3個(gè)時(shí)期但差異不顯著(P>0.05)。河蟹引入生物有機(jī)肥田后，分蘗期的Shannon指數(shù)高于生物有機(jī)肥田的分蘗期且差異顯著(P<0.05)，成熟期的Ace指數(shù)低于生物有機(jī)肥田的同一時(shí)期且差異顯著(P<0.05)。拔節(jié)和抽穗期的Ace、Chao指數(shù)分別高于生物有機(jī)肥田的同一時(shí)期但差異不顯著(P>0.05)。

2種稻田不同生育期的根際土壤通過(guò)高通量測(cè)序獲得的序列可分為55個(gè)門(mén)，174個(gè)綱，397個(gè)目，624個(gè)科，1071個(gè)屬，2292個(gè)種。將相對(duì)豐度<1%的菌門(mén)歸為其它類(lèi)，則所有樣品中綠彎菌門(mén)(Chloroflexi，17.62%～28.44%)、放線菌門(mén)(Actinobacteriota，13.28%～25.53%)、變形菌門(mén)(Proteobacteria，12.35%～19.52%)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteriota，9.28%～14.20%)在2種稻田不同生育期的根際土壤細(xì)菌群落中因占比最高而成為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。此外，樣品中還有脫硫桿菌門(mén)(Desulfobacterota)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirota)、Myxococcota、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadota)、MBNT15、髕骨菌門(mén)(Patescibacteria)和疣微菌門(mén)(Verrucomicrobiota)等(圖1)。在4種優(yōu)勢(shì)菌門(mén)中，生物有機(jī)肥稻田中放線菌門(mén)相對(duì)豐度值最高，河蟹引入生物有機(jī)肥稻田后，則綠彎菌門(mén)相對(duì)豐度值最高且在各時(shí)期的相對(duì)豐度值差異顯著。放線菌門(mén)的相對(duì)豐度值隨著水稻的生長(zhǎng)發(fā)育逐步降低，成熟期最低，各個(gè)時(shí)期的相對(duì)豐度值差異顯著。此外，酸桿菌門(mén)在河蟹有機(jī)肥稻田的各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的相對(duì)豐度值均高于生物有機(jī)肥稻田且差異顯著。變形菌門(mén)在河蟹有機(jī)肥田的拔節(jié)期和抽穗期的相對(duì)豐度值都低于生物有機(jī)肥田，但到成熟期時(shí)則升至最高值但各個(gè)時(shí)期的相對(duì)豐度值差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種稻田不同生育期根際土壤理化性質(zhì)

通過(guò)RDA分別對(duì)2種稻田細(xì)菌群落影響因素進(jìn)行分析，生物有機(jī)肥細(xì)菌群落組成的主要影響因子是pH，河蟹引入生物有機(jī)肥田后，主要影響因子則為速效鉀(AK，圖4)。

表1 2種稻田不同生育期根際土壤理化因子

2.2 2種稻田不同生育時(shí)期土壤細(xì)菌群落高通量測(cè)序統(tǒng)計(jì)分析

高通量測(cè)序結(jié)果顯示，本研究中生物有機(jī)肥田和河蟹生物有機(jī)肥田24個(gè)樣品共獲得849 065條有效序列。覆蓋度均大于0.96接近1.00，說(shuō)明測(cè)序達(dá)到一定深度，基本上能覆蓋所有物種。以97%相似水平為劃分依據(jù)，2種稻田各時(shí)期獲得3177～4031個(gè)OUT(表2)。生物有機(jī)肥田成熟期的OTU數(shù)分別和分蘗期和拔節(jié)期差異顯著(P<0.05)，河蟹進(jìn)入生物有機(jī)肥田后，拔節(jié)和抽穗期的OTU數(shù)有所提升，但差異不顯著(P>0.05)。

MiSeq 高通量測(cè)序所得到的原始數(shù)據(jù)(Raw Data)的雙端序列數(shù)據(jù)經(jīng) Trimmomatic軟件去雜和FLASH(1.2.11)軟件拼接后再通過(guò)QIIME(1.9.1)軟件進(jìn)行質(zhì)控和Usearch軟件去除嵌合體序列即得到優(yōu)質(zhì)序列[13-16]。利用Uparse(version 7.1)軟件按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行操作分類(lèi)單元(OTU)聚類(lèi)，在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。采用RDP classifier(version 2.1.1)貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，并分別在各個(gè)分類(lèi)學(xué)水平上對(duì)比Silva(Release132數(shù)據(jù)庫(kù))統(tǒng)計(jì)各樣本的群落物種組成。利用Mothur(1.30.2) 軟件計(jì)算α多樣性指數(shù)[17-19]，利用 SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。利用CANOCO 4.5進(jìn)行RDA冗余分析，以獲取細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的耦合關(guān)系。

表2 土壤細(xì)菌群落高通量測(cè)序信息統(tǒng)計(jì)分析