人工濕地植物根際微生物對4種污水重金屬元素的凈化能力

羅 倩，林鳳蓮，袁 鋒，潘國營，高倩倩，李 鍵，吳承禎，陳 燦

(1.福建農林大學，福州 350002; 2.武夷學院生態與資源工程學院，福建 南平 354300)

【研究意義】世界范圍內工農業和生活污水重金屬污染嚴重，使得污水處理成為亟待解決的技術難題[1-2]，日益受到關注[3-4]。Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+降解因難、長期性、大規模和不可逆的特性[5]，為水體污染最為嚴重的重金屬，嚴重威脅居民生命安全。植物和微生物是人工濕地系統重要組成成分，開展人工濕地植物根際微生物對重金屬吸附能力研究是解決水體重金屬污染問題的重要途徑。【前人研究進展】目前，處理重金屬污染有物理、化學和生物修復法[6-8]。其中，人工濕地法運行成本低、維護簡便、負荷能力強、污水凈化效率高，微生物降解重金屬越來越受到青睞[9-12]，并被廣泛應用[13]。前人十分重視微生物對重金屬的抗性和解毒作用，構建了植物-微生物-基質的復合緩沖系統，將微生物活細胞作為廉價、高效吸附劑凈化重金屬污水[14-15]。例如：馬佳林等[16]研究得到酵母菌和枯草芽孢桿菌對鈾(VI)的最佳吸附率分別高達97.19%、98.03%；馮旭等[17]研究表明，人工濕地組合回流立式對重金屬As、Cd、Pb、Cu和Zn的平均去除率在50%以上。類似研究大多針對單一金屬離子或停留于重金屬某一時刻去除效果，實際污水成分復雜，面對高濃度污水，菌株存在一定忍耐上限，超過一定閾值，極可能喪失吸附能力甚至死亡，吸附過程中菌株的吸附率也處于動態變化，但內在規律所知甚少，忽視污水中重金屬的初始濃度和動態變化將對菌株吸附能力準確評估產生誤差，也會對篩選最優菌株造成偏差，錯失最優的濕地凈化重金屬方案并對菌劑的配制產生不利影響。【本研究切入點】本文以前期篩選10株優質菌株為研究對象，測量其在不同重金屬初始濃度、不同反應時間去除重金屬離子(Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+)的效果，以期挑選不同初始濃度下重金屬降解能力突出的高效菌株，并進一步探討真菌和細菌吸附污水重金屬的內在機制。【擬解決的關鍵問題】為城市重金屬污水處理系統中高效菌種的選擇提供依據，為微生物菌劑研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 所用菌種采自武夷山市污水處理人工濕地植物再力花(Thaliadealbata)、香根草(Vetiveriazizanioides)、花葉蘆荻(Arundodonaxvar.versicolor)根際土壤，篩選和鑒定所得5株高效細菌B2(Bacilluscereus)、B5(B.thuringiensis)、B19(B.megaterium)、B21(B.thuringiensis)、B35(B.cereus)和5株高效真菌F9(Westerdykelladispersa)、F16(Aspergillusnigerstrain)、F25(Penicilliumjanthinellumstrain)、F26(A.iizukae)、F30(Paecilomyceslilacinusstrain)。其中菌株B2、B5、B35、F9和F16篩選自花葉蘆荻根際土壤，B19、B21和F26篩選自香根草根際土壤，F25和F30篩選自再力花根際土壤。

1.1.2 供試污水 參照武夷山市生活污水處理廠和工業污水處理廠進水水質，用KH2PO4、葡萄糖、蛋白胨、硫酸銨、銅、鋅、鉛、鎘標準溶液、超純水模擬配置不同濃度的模擬污水[19]，詳見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 吸附前后5株細菌和真菌培養和測定參考文獻[20]，重復3組，共測定396個樣品[20]。

表1 不同濃度污水各項指標濃度

1.2.2 重金屬濃度測定方法 取100 mL水樣和5 mL硝酸于200 mL燒杯中，電熱板加熱消解至10 mL左右后滴入5 mL硝酸和2 mL高氯酸，消解至1 mL左右。冷卻定容至100 mL后采用原子吸收分光光度計測定。吸附率公式[21]如下：

R=(C0-Ct)/C0×100%

(1)

式中，C0為溶液中重金屬離子初始濃度(mg/L)；Ct為吸附時間為t時的濃度(mg/L)。

1.3 數據處理和統計分析

采用Microsoft Excel 2013軟件和IBM SPSS Statistics 19.0軟件進行數據分析整合，采用多項式模型對細菌和真菌擬合，基于單因素方差分析(One-Way ANOVA)和多因素方差分析(Multi-Factor ANOVA)，采用最小顯著差異法(LSD法)進行顯著性檢驗和多重比較，顯著性水平為0.05，并采用指數和多項式方程對吸附過程擬合及Origin 2018繪圖。

2 結果與分析

2.1 高效菌株對不同濃度污水Pb2+的吸附效果

整體上10株菌株對Pb2+均有不同程度的吸附作用，吸附時間越長，Pb2+含量越少。由圖1可知，菌株B21和高濃度下B35污水Pb2+濃度變化呈反“J”字型趨勢，菌株F26和F16呈倒“N”字型趨勢，其余菌株均隨時間變化呈下降趨勢，不同時間各菌株濃度變化存在顯著差異(P< 0.05)。不同菌株12 h節點Pb2+濃度微下降，趨勢平穩。48 h后，高濃度污水菌株吸附Pb2+能力表現為B19>F25> B5>F30>F9>F16>B2>B35>F26>B21>CK，吸附率為27.30%～52.27%，其中菌株B19、F25和B5表現優異，吸附能力突出，吸附速率顯著高于其他處理(P<0.05,圖1-A)。

菌株吸附Pb2+效果與污水濃度顯著相關(P< 0.01)，且較低濃度污水中菌株吸附效果顯著優于高濃度污水。菌株B19、F25和F16中濃度污水吸附效果略優于低濃度污水。3種濃度處理48 h后，菌株吸附能力排名表現為B19>F25>B5>F9>F16>F30>B2>F26>B35>B21>CK，吸附率為32.17%～56.07%，3種濃度下菌株的時間越長，菌株吸附率越高，其中菌株B19、F25、B5表現優異(圖1-B)。低濃度下B21、F16和F26的Pb2+濃度呈先下降后上升的趨勢，說明3株菌株吸附率呈突擊式變化趨勢，時間因素對吸附率影響較大。低濃度污水菌株吸附能力排名：B19>F25>F30>B5>F9>F16>B2>B35>F26>B21>CK，吸附率為32.17%～56.07%，其中菌株B19、F25和F30表現優異(圖1-C)。

A.高濃度污水；B.中濃度污水;C.低濃度污水A.High concentration sewage; B.Medium concentration sewage; C.Low concentration sewage圖1 不同菌株處理下不同污水Pb2+濃度的動態變化Fig.1 The dynamic change of Pb2+ concentration in different sewages and strains

由表2可知，不同菌株與濃度、不同菌株與時間、濃度與時間及三者之間均存在顯著的交互作用，不同時間、不同濃度均對菌株吸附率有顯著影響，吸附率顯著高于CK，時間越長，吸附率越高。

處理時間、污水濃度對菌株吸附率影響顯著，不同菌株對Pb2+、Cd2+、Cu2+、Zn2+的吸附率均顯著高于CK。在3個污水濃度中，菌株吸附效果在低濃度和48 h最優,中濃度污水條件下次之，真菌對不同濃度污水重金屬離子吸附效果優于細菌。

2.2 高效菌株對不同濃度污水Cd2+的吸附效果

由圖2可知，不同菌株在不同處理時間段吸附能力存在顯著差異(P< 0.05)，吸附能力差異較大，污水中Cd2+濃度顯著低于CK(P< 0.05)。菌株F26和F30處理下污水Cd2+濃度呈“N字型變化趨勢”，高低濃度下菌株B2和B21處理下Cd2+濃度呈梯度下降后略微上升的趨勢，中濃度處理下的B21趨勢變化較小，其他菌株Cd2+濃度隨時間推移呈下降趨勢。

各菌株的吸附速度及在不同污水濃度吸附能力差異大。菌株F26和B19在高濃度污水和低濃度污水中Cd2+的吸附速度較快，顯著高于其他處理(P< 0.05)，表現優異，其中低濃度污水中菌株F2624 h吸附率達37.57%。中濃度污水下菌株F30、F26、F25和B2吸附速度較快，24 h后吸附率分別為29.67%、25.26%、24.58%和24.24%。48 h后，高濃度污水中不同菌株吸附能力表現為B19>F9>F16>F30>B5>F25>B2>F26>B21>B35>CK，吸附率為29.63%～56.00%，其中菌株B19、F9、F16處理下污水中Cd2+濃度分別為4.400、4.540和4.560 mg/L，吸附率分別高達56.00%、54.60%、54.40%。中濃度污水中不同菌株吸附能力表現為F9>B19>F16>F30>F25>B5>B21>B2>F26>B35>CK，吸附率為31.03%～58.70%，其中菌株F9、B19、F16處理下污水中Cd2+濃度分別為2.065、2.090和2.217 mg/L，吸附率分別達58.70%、58.20%、55.66%。低濃度污水中不同菌株吸附能力表現為：F9>F16>B19>F30>F25>B5> B21>B2>F26>B35>CK，吸附率為31.53%～59.23%，其中菌株B19、F25、B5處理下污水Cd2+濃度分別為0.408、0.414和0.419 mg/L，吸附率分別達59.23%、58.63%、58.07%。

2.3 高效菌株對不同濃度污水Cu2+的吸附效果

由圖3可知，不同菌株對不同濃度Cu2+的吸附能力差異較大，各濃度污水中Cu2+濃度顯著低于

表2 不同濃度、菌株和時間的相關性

A.高濃度污水；B.中濃度污水;C.低濃度污水A.High concentration sewage; B.Medium concentration sewage; C.Low concentration sewage圖2 不同菌株處理下不同污水Cd2+濃度的動態變化Fig.2 The dynamic change of Cd2+concentration under different sewages and strains treatments

CK(P<0.05)。菌株F26和F16處理下Cu2+濃度呈下降—微上升—下降的趨勢，菌株B21和B35處理下Cu2+濃度呈下降—下降—微上升的趨勢，其他處理Cu2+濃度均呈下降趨勢。高低濃度中菌株F16、F26和F30對Cu2+的吸附較快，其中高中低濃度下菌株F16處理24 h后吸附率最高，分別達36.67%、25.90%、29.23%。

不同菌株在不同處理時間下吸附Cu2+能力各異。高濃度污水中菌株處理48 h后，吸附能力表現為F25>B19>F9>F30>F16>B5>B2>F26>B35>B21>CK，吸附率為29.03%～55.73%，其中菌株F25、B19、F9處理下Cu2+濃度為4.427、4.716和4.990 mg/L，吸附率為55.73%、52.83%和50.10%。中濃度污水菌株處理48 h后，吸附能力表現為F25>B19>F30>F9>F16>B5>B2>F26>B35>B21>CK，吸附率為29.83%～57.73%，其中菌株F25、B19、F9處理下污水中Cu2+濃度分別為2.113、2.288和2.491 mg/L，吸附率為57.73、54.23%和50.17%。低濃度污水菌株處理處理48 h后，吸附能力表現為F25>B19>F9>F30>F16>B5>B2>F26>B21>B35> CK，吸附率為35.10%～59.00%，其中菌株F25、B19、F9處理下污水中Cu2+濃度分別為0.410、0.429和0.445 mg/L，吸附率為59.00%、57.06%和55.53%。

2.4 高效菌株對不同濃度污水Zn2+的吸附效果

由圖4可知，不同菌株對Zn2+吸附能力強且差異較大 (P<0.05)。總體來說，菌株B2處理下Zn2+濃度呈下降—微上升—下降的趨勢，菌株F26和F30處理下Zn2+濃度呈下降—下降—微上升的趨勢，高濃度污水中菌株B21和中濃度污水中菌株F9呈同樣趨勢，其他處理污水Zn2+濃度均呈下降趨勢。

不同濃度污水中各菌株吸附Zn2+濃度存在顯著差異(P< 0.05)。48 h后，高濃度污水中菌株吸附能力表現為F16>F25>B19>F9>B5>B35>F30>B21>B2>F26>CK，吸附率為29.67%～56.73%，其中菌株F16、F25、B19處理下污水中Zn2+濃度分別為4.327、4.973和5.023 mg/L，吸附率分別為56.73%、50.27%和49.77%。中濃度污水中吸附能力表現為F16>F25>B19>F9>B5>F30> B35>B2>F26>B21>CK，吸附率為31.27%～58.10%，其中菌株F16、F25、B19處理下污水中Zn2+濃度分別為2.095、2.348和2.500 mg/L，吸附率分別為58.10%、53.03%和50.00%，低濃度污水中菌株吸附能力表現為F16> F25>F9>B19>B5>F30>B35>B21>B2>F26>CK，吸附率為36.00%～60.27%，其中菌株F16、F25、F9處理下污水中Zn2+濃度分別為4.327、4.973和5.023 mg/L，吸附率分別為60.27%、54.00%和49.77%。

A.高濃度污水；B.中濃度污水;C.低濃度污水.A.High concentration sewage; B.Medium concentration sewage; C.Low concentration sewage圖3 不同菌株處理下不同污水Cu2+濃度的動態變化Fig.3 The dynamic change of Cu2+ concentration under different sewages and strains

2.5 不同培養時間菌株對污水的吸附效果

由圖5可知，不同濃度污水中，菌株B19、F9、F25和F16表現優異，吸附速率高，明顯超過其他菌株。在高濃度污水中，不同菌株對重金屬離子的平均吸附率為42.51%，6個菌株吸附率在平均值之上，B2、B21、B35和F26未達吸附率平均值，吸附效率表現較差。菌株B19、 F16和F25吸附率高，平均值分別為4.7283、4.9867和5.0283 mg/L，吸附率達52.80%、50.22%和49.80%，吸附效果較好。其中，菌株F16對重金屬離子Cd2+和Zn2+吸附效果明顯優于Pb2+和Cu2+，前者的平均吸附率為55.63%，后者的平均吸附率為44.8%，吸附率相差10.83%。

中濃度污水中，菌株B19、F25和F16吸附速率較高，平均值分別達2.2687、2.3984 和2.3540 mg/L，吸附率分別為54.65%、52.94%及52.05%。

低濃度污水中，不同菌株對重金屬離子的平均吸附率為46.24%，較高濃度污水吸附率高3.73%，中濃度污水2.13%，6個菌株吸附率在平均值之上，B2、B21、B35和F26未達吸附率平均線，吸附效率表現較差。菌株B19、F16、F25和F9表現較好，吸附率分別達55.12%、53.96%、53.51%、53.29%。

由圖6可知，隨菌株培養時間延長，吸附率呈明顯上升趨勢。12～24 h時，真菌與細菌平均吸附率均表現為急劇吸附階段，真菌平均吸附率達24.66%，細菌達22.38%，幾乎達到平衡時吸附量的50%，其中細菌中Zn2+24 h吸附率達24.43%，高出平均吸附率2.05%。24～36 h時，真菌增長趨勢趨緩，與之不同的是，Zn2+離子吸附率增速加快，平均吸附率為40.54%，高出Cd2+吸附率10.08%，細菌平均吸附率仍呈現快速增長階段，36 h對Pb2+

A.高濃度污水；B.中濃度污水;C.低濃度污水A.High concentration sewage; B.Medium concentration sewage; C.Low concentration sewage圖4 不同菌株處理下不同污水Zn2+濃度的動態變化Fig.4 The dynamic change of Zn2+ concentration under different sewages and strains

離子吸附率為31.15%。36～48 h時，真菌中Pb2+、Cd2+和Cu2+離子重新進入快速吸附階段，吸附平均增長率為15.66%，Zn2+離子吸附增長放緩，增長率僅5.10%，48 h平均吸附率排名為Cu2+> Cd2+> Zn2+> Pb2+。細菌中4種金屬離子吸附率增速趨緩，平均增長率僅7.06%，48 h平均吸附率排名為Pb2+> Zn2+> Cd2+> Cu2+。真菌平均吸附率為46.38%，細菌平均吸附率為40.11%，真菌優于細菌6.27%。

2.6 菌株吸附效果隨時間的模型擬合

為更好揭示菌株吸附過程，基于細菌與真菌平均吸附率變化趨勢線，實驗擬合多項式模型如表3所示。

表3 細菌與真菌擬合模型

圖5 不同菌株處理下不同濃度污水的變化Fig.5 The change of different concentration sewages under different sewages and strains

圖6 不同菌株培養時間下真菌與細菌的平均吸附率Fig.6 The average adsorption rate of fungi and bacteria under different strain culture time

3 討 論

不同菌株對不同重金屬離子親和力不同，真菌優于細菌。有研究表明，藻體對Zn2+、Pb2+的吸附性均高于Cu2+和Cd2+，當最高脅迫濃度 (120 mg/L) 培養至6 d時，桿裂絲藻對Cu2+和Cd2+吸附率差異較大，去除率分別為99.14%和87.73%[22]。與之相比，本研究中，高濃度污水中菌株培養2 d后，B19對Cu2+和Cd2+吸附率較低(52.87%、56.12%)。菌株F16對重金屬離子Cd2+和Zn2+吸附效果明顯優于Pb2+和Cu2+，菌株B2對Zn2+的吸附速率顯著大于Pb2+、Cd2+和Cu2+的吸附速率，這可能與不同菌株細胞活性不同有關[22]。Neethu等[23]研究表明130株腸桿菌和假單胞菌對不同重金屬耐受性不同，原因主要在于外排泵和莢膜多糖的產生，但更多與細胞質粒有關。Martins等[24]研究指出，P.citrinum,P.brasilianum,P.funiculosum和P.janczewskii4種物種比其他離子能更有效地去除鉛，真菌P.brasilianum對鉛具有更好的親和力，與本文結果一致。本試驗中，真菌對污水中重金屬的吸附率大于細菌(6.48%)，前者平均吸附率為47.53%，后者平均吸附率為41.05%，這可能由于本試驗中篩選出的真菌菌絲較多，搖瓶培養過程中與金屬離子接觸面積較大，提高了真菌的吸附率。

微生物對重金屬的吸附效果與污水中重金屬濃度密切相關，中低濃度優于高濃度。本試驗中，高濃度污水中菌株B21對Pb2+吸附度呈現上升—上升—下降的變化趨勢，從9.35 mg/L降至6.28 mg/L后又升至7.24 mg/L，說明時間越長，吸附能力越低，吸附能力與初始濃度負相關，這可能與菌株對重金屬離子濃度有一個耐受范圍有關，超過其耐受范圍可能會抑制菌株，降低菌株活性，去除率則隨時間變化呈下降趨勢[25]。趙琪琪等[26]研究表明莖點霉屬 (Phomasp.)最大耐受濃度為 6000 mg/L，濃度越高，生物量減少越快，印證了中低濃度下微生物對重金屬離子吸附率較高，與本文研究一致。本研究發現，重金屬起始濃度對重金屬吸附有一定影響，菌株在中低濃度污水中平均離子吸附率為45.17%，遠高于高濃度污水中42.51%，中低濃度污水吸附率優于高濃度，這可能由于重金屬濃度過高導致微生物表面結合位點不足，加劇離子間互相競爭，影響吸附效率[27]。毛凱等[28]研究表明溶液初始濃度為0～2 mmol/L時Zn2+的吸附量增加明顯,當濃度超過2 mmol/L時吸附量開始趨于飽和，低濃度中吸附效率高，與本研究結果一致。不同菌株對不同重金屬離子吸附效果差異較大還受微生物遺傳特性和金屬離子屬性等因素有關[29]。

菌株培養時間對金屬離子吸附效果影響較大，兩者呈顯著指數正相關關系(P<0.01)。本研究中，菌株F16、F26和B2吸附率呈快速下降后趨緩的趨勢，Cd2+離子變化不明顯，這可能由于金屬離子在胞外和胞壁共同作用下，大量有機物分泌促使離子沉淀[30]，消耗過多能量，離子進入細胞內部時，吸附速率減小。Li等[31]研究指出實驗開始僅1 h菌株C.lacerata對銅的吸附率高達86%，隨后緩慢降低，原因可能在于其pH值降低導致H+離子與Cu2+和CuOH+離子競爭，影響生物吸附位點。本研究發現，菌株F26和B21呈下降—下降—微上升的趨勢，高濃度污水中菌株B2呈同樣趨勢，這可能由于重金屬離子通過膜表面的轉運蛋白進入細胞內部[32]后，細胞化合有機物被分解，使部分重金屬離子回到溶液，致使濃度回升，或因細胞內部泵加大工作力度，將內部離子排出，具體機制待進一步探索。本試驗中，B5、B19、F25等菌株吸附率隨培養時間延長呈階梯式下降趨勢，這可能因為胞外富集、沉淀，胞壁絡合、胞內富集同時運作[33]，細胞分泌有機物使離子沉淀，胞壁進一步吸附，胞內緩慢沉降，使得重金屬離子吸附率呈線性過程。

微生物吸收階段的參與度以及分泌物數量可能是影響重金屬吸收效果主要內在機制。微生物吸附重金屬的過程主要分為兩個階段：第一個階段是微生物可通過自身生長的過程中產生的蛋白質、多肽及羧酸等物質與重金屬絡合快速吸附重金屬離子；第二階段是重金屬離子經微生物活體細胞的主動吸附，與酶結合實現細胞內富集，過程較為緩慢[34]。本研究中， B35、F16和F25等菌株吸附率呈明顯上升趨勢，其中菌株F25在高濃度污水中Pb2+濃度從9.294 mg/L 經48 h后降至4.854 mg/L，降低了4.44 mg/L，吸附速率較快，說明菌株吸附率呈突擊式變化趨勢，分泌物數量增加，這可能與微生物參與度不斷提高有密切關系，處理時間越長，微生物生物量和分泌物增加，菌株菌體及產生的酶與污水中重金屬離子的接觸率增加，微生物吸收階段參與度提高，明顯提高了污水離子吸附率[35]。

本試驗利用單菌懸液凈化污水，并未進行不同菌株間的配比試驗及所用污水來自實驗室自配污水，與自然條件下的污水差異較大，后續試驗可將室內試驗推廣到室外試驗，更好模擬自然條件，以探究自然條件下菌株對不同污染物的凈化效果，同時本次試驗未涉及pH值測定和生物吸附劑等因素對菌株吸附率的影響，吸附機理尚未完全驗證，今后研究將細化明確胞外沉淀、胞壁吸附及胞內排放相關機制。

4 結 論

(1)從4株人工濕地植物根際土壤中所得5株真菌和5株細菌菌株，共測定396個樣品，其中B19、F16、F25、F9是中高低濃度重金屬凈化的優勢菌株。

(2)不同處理時間、污水金屬初始濃度和菌株種類均對吸附污水中重金屬離子的效果有顯著影響。

(3)菌株對重金屬的吸附效果在低濃度和48 h最優且真菌優于細菌，細菌平均吸附率符合指數函數模型，真菌平均吸附率符合冪函數模型。