基于線粒體DNA和短串聯重復序列技術的牛親子鑒定

郭 帥，熊 琪，陶 虎，楊 娟，韓世昌

(1.湖北省農科院畜牧獸醫研究所，武漢 430000；2.華中農業大學動物科技學院，武漢 430000)

【研究意義】我國是世界上牛品種最多的國家，共有53個地方品種和8個培育品種[1]。近年來，由于外來品種的引進，我國原有的地方品種資源在逐漸減少，對牛的品種篩選與繁育變得至關重要。牛的親子鑒定是牛品種篩選的重要環節。【前人研究進展】微衛星標記就被認為是表征品種遺傳多樣性的首選標記[2]。Chaudhari等[3]利用25對熒光微衛星標記對Kenkatha和Gaolao這2個品種的牛進行了分子鑒定，證明這2個品種間幾乎沒有遺傳分化。Acosta[4]利用30對微衛星標記評估了5個古巴牛品種的遺傳多樣性和關系，結果顯示當地牛群中保持了大量的遺傳變異。Novoa和Usaquén 等[5]檢測了來自哥倫比亞的178只婆羅門牛的11個微衛星標記多態性，結果顯示婆羅門牛的高度雜合性，揭示了品種起源。李芳玉[6]對云嶺牛線粒體DNA全基因組遺傳多樣性研究發現，云嶺牛是以云南地方黃牛為母本進行培育的肉牛品種，包括普通牛和瘤牛2個母系起源，且以瘤牛起源為主。李榮嶺等[7]采用熒光標記引物擴增STR，通過全自動基因分析儀檢測基因型，這種高通量檢測方法準確、可靠，但檢測費用昂貴。Ciampolinie 等[8]將1個由54頭荷斯坦牛與4頭意大利肉牛組成的測試組，用微衛星DNA測定，結果顯示4頭‘意大利牛’之間的遺傳相似度較高，54頭‘荷斯坦?！g的遺傳相似度低。吳偉等[9]利用4種微衛星標記對5個中外牛品種/群體遺傳結構進行研究，發現西門塔爾牛自成一類，延邊牛、韓牛為一類，南陽牛和雜種牛為一類。張自富等[10]利用微衛星標記技術研究了14個中外黃牛品種的遺傳多樣性，篩選出ILSTS005和ETH10 2個微衛星位點。【本研究切入點】親子鑒定是通過分子生物學、分子遺傳學和醫學等技術手段，分析親代和子代的遺傳特性，從而判斷是否具有親緣關系[11-12]。親子鑒定的遺傳基礎是孟德爾的遺傳定律，包括基因分離和自由組合規律。在家畜的親子鑒定中，通常使用排除法和似然法。排除法是利用各個位點的等位基因頻率把不是親生父親的候選父親排除的概率。似然法是通過建立候選父親和子代的似然函數，在一定置信水平下為子代找到最似親本[13]?！緮M解決的關鍵問題】本研究中共有3頭牛，通過Sry雄性特異性基因檢測來證明這3頭牛的性別，再根據終止法測序，比對mtDNA的D-loop區的位點突變情況，最后根據STR位點基因型來確定3頭牛的親子代關系。

1 材料與方法

1.1 樣品

爭議公牛C和嫌疑母牛A、B的外周血液樣品。

1.2 試劑

基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖購自上海貝晶生物技術有限公司。

1.3 利用mtDNA D-loop區遺傳標記進行牛母系血緣鑒定

采用Tris-飽和酚提取牛外周血液DNA。根據牛mtDNA的D-loop區設計引物(表1)，以牛外周血基因組DNA為模板，進行PCR擴增，擴增產物經1.5%瓊脂凝膠電泳回收純化后，以雙脫氧鏈終止法進行測序。Mutation Surveyor軟件(v5.0.2)分析測序結果后，判斷親權關系。以牛 Sry 基因作為雄性特異性基因設計引物，并進行PCR擴增，用于性別鑒定。

PCR反應條件：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，共35個循環；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 保存，PCR擴增體系如表2所示。

1.4 利用微衛星遺傳標記進行牛單親親權鑒定

采用Tris-飽和酚法提取牛尾靜脈血DNA。選定的位點除了BM1824、BM2113、INRA023、ETH10、ETH225、SPS115、TGLA227、TGLA122這8個作牛的親權鑒定必須包括在內的“國際標記組”外，參考賀建寧[14]的研究結果，增加了有豐富等位基因、高多態性特點的INRA037、INRA032、CSSM66、TGLA53和HAUT275個STR位點。合成13個STR位點，進行PCR擴增，并于AB 3130xl 遺傳分析儀進行毛細管電泳分離、收集熒光信號、自動分析PCR 產物的長度，運用GeneMarker軟件(v2.2.0)自動分析各等位基因的基因型。

2 結果與分析

2.1 線粒體D-loop區檢測結果

牛A、牛B和牛C的線粒體D-loop區PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，擴增產物約1000 bp，條帶單一，無非特異性擴增條帶(圖1)。Sry雄性特異性基因檢測結果(圖1)顯示，只有牛C的Sry雄性特異性基因可以形成擴增條帶，表明牛A和牛B為雌性個體，與送檢樣品標注相符。

mtDNA的D-loop區PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠回收純化后，用雙脫氧鏈終止法測序，并進行序列比對。與參照序列(AY337535)相比，牛B、牛C的mtDNA D-loop區雙脫氧鏈終止法測序結果共檢測到47個突變，牛A共檢測到46個突變(表3)，其中牛B mtDNA D-loop區的47個位點與牛C突變方式完全一致，而牛A的291A>G這個位點與參照序列(AY337535)相同，不同于牛C。以上mtDNA D-loop區測序分析結果表明，牛B與牛C是來源于同一母系的個體。

表1 牛mtDNA的D-loop區鑒定使用的引物

表2 PCR擴增體系

圖1 牛A、牛 B和牛C的mtDNA D-loop區及Sry基因PCR產物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of mtDNA D-loop region and Sry gene PCR products of cow A,cow B and cow C

表3 被鑒定對象mtDNA D-loop區測序結果與參照序列(AY337535)的比對情況

表4 13個位點等位基因的基因型

2.2 微衛星標記檢測結果

13個STR位點的PCR產物均有條帶(圖2)。3件送檢樣本的BM1824、BM2113、INRA023、ETH10、ETH225、INRA037、INRA032、CSSM66、SPS115、TGLA53、TGLA227、TGLA122、HAUT27基因座中均檢出基因型(即等位基因片段后者大于前者)。利用AB 3130xl 遺傳分析儀對13個位點的擴增產物進行毛細管電泳分離。牛B和牛C的BM1824位點符合孟德爾遺傳規律(圖3)，而牛A與牛C在這個位點不符合(因為牛B基因型片段小于等于牛C，牛A基因型片段比牛C大)。牛B和牛C在13個STR位點的基因型全部符合孟德爾遺傳規律(表4)，牛A和牛C在1號染色體的BM1824位點、2號染色體的BM2113位點、3號染色體的INRA023位點、10號染色體的INRA037位點、11號染色體的INRA032位點、16號染色體的TGLA53位點和26號染色體的HAUT27位點不符合孟德爾遺傳規律。

圖2 牛A、牛 B和牛C的1～13個微衛星標記PCR產物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR products of 1-13 microsatellite markers in cow A,cow B and cow C

3 討 論

mtDNA(mitochondrial DNA)又稱線粒體DNA，是重要的遺傳標記，是細胞中唯一的核外基因組DNA[15]。線粒體以母系遺傳方式遺傳，不受染色體重組的影響，可彌補微衛星因發生重組影響基因頻率和基因型頻率，最終導致鑒定率降低的不足。同時，線粒體拷貝數多，每個細胞含有10～1000個線粒體，多數線粒體內含有多拷貝的mtDNA，因此對mtDNA的檢測比核基因組DNA(nDNA)的靈敏性高，具有更高的檢出率[16]。但是線粒體DNA存在結構多樣性，且單獨使用線粒體DNA測序技術作為分子標記存在一定的缺陷[17]。

根據本次送檢樣品的檢測結果，基本可以排除牛A與牛C具有親子關系的可能性。鑒于牛B和牛C的 mtDNA D-loop區47個位點的突變方式完全相同，該方法檢測結果只能說明牛B與牛C有母系血緣關系，其親子關系還必須通過常染色體STR來確定。

STR本研究共選定為位點除了BM1824、BM2113、INRA023、ETH10、ETH225、SPS115、TGLA227、TGLA122這8 個作牛的親權鑒定必須包括在內的“國際標記組”外，還增加了INRA037、INRA032、CSSM66、TGLA53和HAUT27這5個STR位點。其中INRA037位點等位基因數為14，多肽信息含量為0.671；INRA032等位基因為8，多肽信息含量為0.537；CSSM66等位基因數為11，多肽信息含量為0.734；TGLA53等位基因數為18，多肽信息含量為0.881；HAUT27等位基因數為11，多肽信息含量為0.737。王均輝等[18]研究發現，秦川牛的平均多肽信息含量為0.7686，平均雜合度為0.7959。王敏強等[19]研究發現，魯西黃牛平均多肽信息含量為0.797，平均雜合度為0.820；渤海黑牛的平均多肽信息含量為0.798，平均雜合度為0.821；秦川牛的平均多肽信息含量為0.795，平均雜合度為0.819。遺傳連鎖分析顯示，多肽信息含量大于0.7的微衛星位點為最理想的選擇標記，所以本實驗中13個STR可以作為進一步連鎖分析的候選遺傳標記和個體鑒定。母牛B和公牛C在13個STR基因座均符合孟德爾遺傳規律[12]，相對親權概率(RCP)為99.99%，母牛B是公牛C的生物學母本的幾率大于99.99%；母牛A和公牛C之間有7個STR基因座不符合孟德爾遺傳規律，因此，排除母牛A與公牛C具有親子關系的可能性。

圖3 1號染色體BM1824位點毛細管電泳結果Fig.3 Results of capillary electrophoresis at bm1824 site on chromosome 1

吳繼法等[20]在研究中選用了36個STR位點，采用熒光多重PCR，對涼山半細毛羊進行親子鑒定，得到的累積非父概率為99.999 999%。賈名威等[21]研究顯示，采用6個STR位點，得到奶牛的累積非父排除率98.827%，肉牛累積非父排除率99.578。其結果低于國內外親子鑒定的標準。本研究所檢測的13個基因座既可以達到國內外親子鑒定的精確度要求，又做到實驗操作簡便，成本較低，更加適應生產實際。這13個基因座具有高遺傳多態性，在同一模板濃度下，各位點PCR擴增產物經過遺傳分析儀分析，得到的檢測峰信號較強且峰型好。本研究采用的STR復合擴增[22]、熒光標記、毛細管電泳檢測[23]、GeneMarker軟件[24]分析的方法優點較多，比如高分辨率、高準確度、速度快等，表明這種方法在動物遺傳研究中有很強的實用性[25]。

4 結 論

根據mtDNA D-loop基因分型結果，確定牛B與牛C具有母系血緣關系，排除牛A與牛C存在母系血緣關系。根據DNA遺傳標記分型結果，確定牛B是牛C的生物學母親；排除牛A是牛C的生物學母親，說明該方法用于牛親子鑒定具有可靠性。