草莓雜交品種及其親本遺傳背景的ISSR分析

張運峰，武秋穎，張淑紅，高鳳菊，范永山，韓靖玲，劉海英

(1.唐山師范學院生命科學系，河北 唐山 063000；2.唐山市農業科學研究院，河北 唐山 063000；3.唐山市植物病原真菌與毒素重點實驗室，河北 唐山 063000)

【研究意義】草莓(Fragaria×ananassaDuch.)果實味道鮮美、營養物質豐富，為世界七大水果之一[1]。20世紀初傳入中國后，草莓產量和種植面積均為世界第一，有“水果皇后”的美譽[2]。栽培草莓為異源八倍體多年生草本植物，遺傳背景非常復雜，遺傳育種工作相比于二倍體植物更加困難?！厩叭搜芯窟M展】自20世紀80年代草莓育種方式由實生選種改為雜交育種以來[3]，草莓的遺傳背景研究越來越重要，因為遺傳背景差異越大的親本，其雜種優勢越強。但是，關于草莓遺傳背景的研究報道很少。常琳琳等[4]利用系譜法分析了1953—2016年我國培育的108個草莓品種的親本類型和來源，總結了草莓育種親本的選配規律。但是，由于草莓品種交叉引種、自育自繁等活動頻繁，缺乏系譜資料或系譜資料不全、不準確等現象非常普遍。分子標記技術以基因組DNA序列的多態性為基礎，不受取材部位、發育時期和外界環境的干擾，對于遺傳背景復雜、倍性高的草莓研究中具有顯著優勢。Sargentd等[5-7]研究表明，栽培草莓基因組的很多分子標記都呈現二倍化分離，因此，分子標記技術是解析栽培草莓復雜遺傳背景的有效途徑。ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)是一種在微衛星基礎上發展的分子標記，不具有較強的種特異性，揭示的多態性高，檢測非常方便[8]，已廣泛應用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性的研究中[9]?！颈狙芯壳腥朦c】以12種具有不同遺傳背景的栽培草莓品種為研究對象，利用ISSR技術和多維尺度分析技術解析它們之間的親緣關系，為草莓品種鑒定、雜交種質篩選提供技術基礎?！緮M解決的關鍵問題】建立草莓ISSR擴增的最適引物，探索基于ISSR試驗數據的系統聚類分析與多維尺度分析技術相結合的綜合技術體系來準確評估草莓的遺傳背景和親緣關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

草莓試驗材料均采自唐山市農業科學研究院草莓種植基地。12份草莓材料中1份來自美國，1份來自西班牙，4份來自日本，6份來自中國。除了章姬脫毒苗的變異株唐研香以外，其它均為省級或國家級審定品種。12份試驗材料中有9份遺傳背景清楚，其中5份材料(京桃香、粉紅公主、妙香一號、唐研香、紅顏)的親本來源于章姬，2份材料(佐賀清香、幸香)源于豐香，1份材料(紅袖添香)源于章姬和幸香雜交的F1代紅顏；其余3份材料的遺傳背景未知(表1)。

1.2 草莓試驗材料的ISSR擴增

采取草莓植株幼嫩的葉片，利用磁珠基因組DNA微量提取試劑盒(上海生物工程技術服務有限公司)提取基因組DNA，利用Takara rTaqDNA聚合酶進行ISSR擴增：基因組DNA 50 ng，10×PCR buffer 2.0 μL，2.5 nmol/L dNTPs 1.5 μL，10 μmol/L引物2.0 μL，5 U/mL rTaqTM0.2 μL，ddH2O補充到20 μL；經95 ℃預變性后進行35個熱循環(94 ℃ 40 s，45～55 ℃ 70 s，72 ℃ 1 min)，最后72 ℃再延伸8 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠、3 V/cm電壓進行電泳分離，利用Bio-Red凝膠成像系統采集電泳圖像。利用章姬、京桃香、粉紅公主、妙香一號、紅顏和唐研香等6個品種從100條ISSR引物中篩選出條帶清晰、多態性位點多、擴增產物穩定的ISSR引物，摸索不同ISSR引物的最適退火溫度(Tm)，對全部試驗材料進行ISSR擴增。

1.3 草莓試驗材料的遺傳背景分析

ISSR-PCR產物在0.5倍TBE電泳緩沖液中以3 V/cm電壓、1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，Bio-Red凝膠成像系統采集電泳圖像。根據電泳圖譜記錄清晰可重復的電泳條帶，清晰且可重復的條帶記為“1”，無法辨認且難以重復的條帶記為“0”，獲得“0-1”數據矩陣。利用NTSYS-pc version 2.02(Rohlf，1998)計算遺傳距離和Nei& Li 遺傳相似性系數，利用UPGMA(Unweighted Pair Group Method Using Arithmatic Average)方法進行聚類分析；用IBM SPSS Statistics version 19.0.0軟件進行多維尺度分析(Multidimensional scaling，MDS)。

表1 草莓種質信息

2 結果與分析

2.1 ISSR引物篩選及最適Tm值摸索

利用章姬、京桃香、粉紅公主、妙香一號、紅顏和唐研香6個品種進行最適ISSR引物篩選。結果表明，在100條ISSR引物中篩選出10條引物可獲得反應穩定、條帶清晰、多態性強的擴增條帶(表1)。對這些引物進行最適Tm值摸索，結果表明10條ISSR引物的最適Tm值差異較大，在47～54 ℃之間(表1)。隨著Tm值的增加，不同引物的擴增條帶數量變化不同。例如，在45～55 ℃范圍內，引物892在Tm值低于50 ℃時擴增條帶數量隨著溫度的增加而增加，高于50 ℃時擴增條帶數量逐漸減少，而引物811在Tm值為52.3 ℃時條帶數量達到最多后，再增加溫度，擴增條帶數量無顯著改變(圖1)。

2.2 草莓試驗材料的ISSR-PCR擴增

利用篩選的ISSR引物和摸索的最適Tm值對12份草莓試驗材料進行ISSR-PCR擴增。結果表明，10條引物均能在12個草莓品種中擴增出清晰明亮的條帶，且條帶數目均在8條以上(表2，圖2)。試驗共獲得標記條帶116條，其中引物859和引物892的條帶數目超過了15條。試驗共獲得多態性條帶80條，多態性比率為68.97%。除了引物857的條帶多態性比率(37.5%)較低以外，其它9個引物的多態性條帶比率均超過了50%，其中引物812和引物892超過了85%(表2)。以上試驗結果表明，10個引物形成的標記可以很好的區分草莓品種。

2.3 草莓試驗材料間的遺傳相似系數和遺傳距離

12份材料間的遺傳相似系數變化范圍為0.5690～0.8448，遺傳距離變化范圍為0.1456～0.4722。紅顏和白雪公主間的遺傳相似系數最高(0.8448)，甜查理和圣誕紅間的最低(0.5690)。章姬與其5份子代材料(京桃香、粉紅公主、妙香一號、唐研香、紅顏)的遺傳相似系數為0.6983～0.7951，變化范圍較小，說明遺傳背景比較相近。均來自于豐香親本的子代佐賀清香和幸香間的遺傳相似系數為0.7414；紅顏與其親本章姬和幸香，以及子代材料紅袖添香的遺傳相似系數分別為0.7931、0.7759和0.7241，遺傳背景非常相似(表3)。3個遺傳背景未知的試驗材料中，甜查理和粉紅公主的遺傳相似系數最高(0.7500)，這與粉紅公主有美國遺傳背景非常一致(表1～3)；圣誕紅除了與唐研香的遺傳相似系數較高(0.7155)外，與其它所有試驗材料的遺傳相似系數均較低，這與圣誕紅來自于西班牙，而其它試驗材料中均沒有西班牙遺傳背景相一致；白雪公主與紅顏的遺傳相似系數最高，推測它可能是紅顏的子代或組培變異株。

1～5分別為44.2、47.5、50、52.3和54.4 ℃；M：DNA Marker-D1 to 5 are 44.2, 47.5, 50, 52.3 and 54.4 ℃；M is DNA Marker-D圖1 不同Tm值條件下ISSR引物892(A)和811(B)的擴增結果Fig.1 The amplification results of ISSR primers 892 (A) and 811 (B) under different Tm values

表2 ISSR引物信息及擴增結果

1.章姬；2.京桃香；3.粉紅公主；4.妙香一號；5.唐研香；6.紅顏；7.紅袖添香；8.佐賀清香；9.幸香；10.甜查理；11.圣誕紅；12.白雪公主；M.DNA marker D1.Akihime;2.Jingtaoxiang;3.Fenhonggongzhu;4.Miaoxiangyihao;5.Tangyanxiang;6.Benihoppe;7.Hongxiutianxiang;8.Sagahonoka;9.Sachinoka;10.Sweet Charli;11.Ssanta;12.Snow White;M.DNA marker D圖2 引物895(A)和851(B)的ISSR-PCR結果Fig.2 The ISSR-PCR results of primers 895(A) and 851(B)

計算遺傳背景明確的各試驗材料之間的平均遺傳距離和平均遺傳相似系數，分析各雜交品種及其親本的遺傳傾向性。結果發現：親本之間平均遺傳距離0.3258，平均遺傳相似系數0.6551；親本與子代之間遺傳距離0.1950～0.3628(平均0.2607)，遺傳相似系數0.7241～0.7845(平均0.7478)；親本與

表3 12份草莓材料的遺傳相似系數(右上)和遺傳距離(左下)

表4 12份草莓材料的遺傳傾向性分析

組培變異株之間遺傳距離0.1981，遺傳相似系數0.7672。可見，親本之間、親本與子代之間和親本與組培變異株之間的遺傳距離遞減，而遺傳相似系數遞增，符合遺傳規律。以上研究結果表明，本試驗篩選出的ISSR引物能夠較好地用于草莓種質材料的遺傳背景分析。

2.4 草莓試驗材料間的聚類分析

根據遺傳相似系數建立系統發育樹(圖3)，利用NTSYS-pc軟件對聚類樹進行Cophenetic相關性檢驗，相關性系數為r=0.78174，說明聚類結果較好。當遺傳相似系數為0.70時，12份試驗材料可分為美國材料甜查理(群I)、日本和中國材料(群II)和西班牙材料圣誕紅(群III)，說明中國的草莓品種的遺傳背景主要來自日本品種。當遺傳相似系數為0.75時，群II還可分為京桃香和佐賀清香(群II-1)，章姬、紅顏、白雪公主和唐研香(群II-2)，幸香(群II-3)，及粉紅公主、紅袖添香和妙香一號(群II-4)等4個亞群。在群II內，群II-1和群II-4都是雜交子代，群II-2(除紅顏外)和群II-3都是親本或親本的組培變異株。紅顏與父本幸香沒有歸到同一亞群，而與母本章姬歸到同一亞群，說明紅顏在遺傳背景上更接近其母本章姬，并且也具有作為其它品種雜交親本的品質。以上研究結果說明，利用本試驗篩選的ISSR引物可應用于雜交親本的篩選。

圖3 草莓試驗材料的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of strawberry trial materials

2.5 多維尺度分析

基于Nei& Li 遺傳距離利用SPSS軟件進行多維尺度分析(圖4)，stress = 0.09139，RSQ(stress and squared correlation)= 0.98504，說明多維尺度分析效果較好。從圖4可以看出，12個試驗材料分布于I、II和III區。I區僅有紅袖添香，其雜交親本是美國品種卡姆羅莎(Camarosa)與日本品種豐香。II區可分為兩類，II-1為西班牙品種圣誕紅，II-2包括章姬、唐研香、京桃香、佐賀清香、紅顏和幸香共6個品種，其中中國品種唐研香、紅顏和京桃香的親本均為日本品種章姬，佐賀清香和幸香的親本都是日本品種豐香，并且紅顏是章姬和幸香的雜交F1代。III區也可分為兩類，III-1為美國品種甜查理，III-2包括中國品種粉紅公主、白雪公主和妙香一號，其中粉紅公主和妙香一號的親本均為日本品種章姬。還可以發現，II-2和III-2距離非常近，它們均為中國和日本的品種。以上研究結果與圖3相似，從另一角度表明本試驗篩選的ISSR引物對于草莓品種的遺傳背景分析非常有效。

3 討 論

在植物遺傳多樣性分析過程中RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA)的結果精度和穩定性較差，AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，擴增片段長度多態性)設計步驟復雜，SSR (simple sequence repeats，簡單重復序列)種特異性較強，SNP(single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態性)則依賴高通量測序和大數據庫。草莓遺傳背景分析主要用于篩選具有雜種優勢的親本材料以及探索親本與雜交后代之間的親緣關系，檢測樣本多，檢測工作量大。因此，穩定性強、操作簡便、重復性好、多態性高、技術易掌握的分子標記技術更適合草莓的遺傳背景分析。ISSR標記結合了RAPD和SSR的優點，具有DNA模板用量小、實驗成本低、操作簡單的優點[14]，同時還兼具多態性豐富、穩定性高的優良特性[15]，因此，本研究采用ISSR技術開展草莓的遺傳背景分析。

圖4 草莓試驗材料的多維尺度分析Fig.4 Multidimensional scaling analysis of strawberry trial materials

利用ISSR標記分析草莓種質材料的遺傳背景，關鍵是找到適合的ISSR引物。本試驗篩選出的10條ISSR引物，并獲得了擴增條帶的多態性“0-1”數據，經過統計分析發現草莓各品種的遺傳相似系數和遺傳距離的分析結果一致，系統聚類分析和多維尺度分析結果一致，親本之間、親本與雜交后代之間、親本與其組培變異株之間的遺傳距離、遺傳相似系數、聚類結果和多維尺度分析結果均較好地反映出了試驗材料間的親緣關系。因此，遺傳距離、遺傳相似系數、系統聚類和多維尺度分析相結合，可以全面地分析草莓雜交品種及其親本的遺傳背景。根據試驗結果，發現未知遺傳背景的草莓品種白雪公主與紅顏和章姬親緣關系最近，推測白雪公主的親本材料里有紅顏和(或)章姬。ISSR分析結果顯示各草莓品種間平均相似系數較高，表明采集草莓品種間遺傳背景單一，且多數有日本草莓品種的遺傳背景，但是日本草莓品種的品質較好，但一般抗病性較差[16]，這種現象如果不改變，不僅育成草莓新品種難有較大的突破，也增加了草莓抗病育種的難度。

4 結 論

草莓ISSR遺傳背景分析表明我國的草莓品種與美國、西班牙的品種親緣關系較遠，與日本品種的親緣關系很近，且遺傳背景比較狹窄，品種之間的遺傳差異也較小。因此，拓寬草莓遺傳背景、增加草莓品種遺傳多樣性，將成為我國草莓生產、種質資源創新和育種工作的重要任務。