神經毒素BMAA在淡水池塘水體中的健康風險及調控技術

顧笑笑 吳 湘 張 愛 俞程強 楊林浩 孫 怡 李珍珍

(湖州師范學院生命科學學院， 浙江省水生生物資源養護與開發技術研究重點實驗室， 湖州 313000)

β-N-甲氨基-L-丙氨酸(β-N-methylamino-Lalanine， BMAA)是一種由藍藻產生的具有慢性神經毒性的藻毒素， 被認為是誘導肌萎縮側索硬化-帕金森癡呆綜合征(ALS-PDS)的重要環境因子[1]。Purdie等[2]通過對斑馬魚的體外實驗推測BMAA可以形成一種類似谷氨酸酯的物質而促使神經元退化， 誘發神經發育系統或者神經肌肉的異常。BMAA毒素具有生物累積和生物放大效應[1，3—8]， 在深受藍藻水華污染的淡水養殖生態系統中生長的養殖產品也極易吸收、富集和放大BMAA毒素而最終進入人體。我國作為世界第一水產養殖大國， 關注和調查淡水養殖生態系統中BMAA毒素的污染水平及在水產品中的富集效應， 并對其進行健康風險評估已顯得尤為迫切和亟需。

此外， 如何安全、高效、經濟地調控藻毒素的污染問題一直是學者研究的熱點和重點。近年來，以水生植物化感物質[9—12]和緩釋顆粒技術[13—16]為基礎制備的化感緩釋抑藻劑對產毒藍藻進行生長抑制， 從而有效控制藻毒素產生與釋放為解決藻毒素污染問題提供了新思路與新方法。本文重點針對BMAA毒素在環境中降解緩慢等特點， 開發以沒食子酸為化感物質、氧化石墨烯為控釋載體的新型化感緩釋抑藻劑用于抑制產毒藍藻生長和調控BMAA毒素污染， 研究結果將對保障我國淡水養殖產業的安全生產和人類健康具有重要的意義。

綜上所述， 本文擬通過調查和檢測BMAA毒素在我國長江中下游地區典型淡水養殖生態系統的養殖水體、底泥及6種常見淡水養殖產品(河蜆Corbiculafluminea、銅銹環棱螺Bellamya aeruginosa、日本沼蝦Macrobrachium nipponense、中華絨螯蟹Eriocheirsinensis、青魚Mylopharyngodon piceus和鯽Carassius auratus)中的污染水平， 開展BMAA毒素對人體的健康風險評估， 并在此基礎上初步提出基于我國國情的淡水養殖產品質量安全的BMAA毒素建議標準限值(GV); 同時針對新型化感緩釋抑藻劑的制備、調控BMAA毒素污染的效果及其生態安全性評價等方面逐一開展研究， 為其今后高效、安全地應用于藍藻水華頻發的淡水養殖池塘藻毒素污染治理提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集、處理與檢測

水體、底泥及生物樣品的采集與處理本實驗于2019年7—9月在湖州市淡水養殖區域隨機選取3類藍藻水華暴發嚴重的淡水混合養殖池塘(河蜆+鯽混養、日本沼蝦+中華絨螯蟹混養、青魚+銅銹環棱螺混養)作為BMAA調查采樣的研究對象， 上述每種混養池塘數量均設置為3個， 分別采集其養殖水體、底泥及養殖生物樣品(圖1)。每個池塘設置4個采樣點， 分別取其深層水及淺層水均勻混合得到養殖水體樣品; 采泥3次后均勻混合得到底泥樣品。水樣過500目不銹鋼篩后經0.45 μm醋酸纖維濾膜減壓抽濾2次， 于-20℃凍存; 底泥去除雜物， 冷凍干燥處理后置于研缽中研碎， 于-20℃凍存; 同時在對應的單個養殖池塘中隨機獲取河蜆10只(體長6—9 mm)、銅銹環棱螺10只(殼高15—22 mm)、日本沼蝦20只(體長5—6 cm)、中華絨螯蟹5只(體重100—150 g)、青魚3尾(體長75—85 cm)和鯽10尾(體重180—200 g)， 冷藏保存并帶回實驗室解剖， 取肌肉組織粉碎勻漿， 于-80℃保存。

圖1 采樣點位示意圖Fig. 1 Schematic diagram of sampling points

樣品中BMAA含量的測定取水樣經Waters Oasis MCX 混合型陽離子交換反向吸附柱處理(活化: 2 mL甲醇， 調整: 2 mL超純水， 上樣: 1.5 mL水樣， 淋洗1: 2 mL 2%甲酸， 淋洗2: 2 mL甲醇， 洗脫:2.5 mL 5%氨化甲醇)并收集洗脫液[8]。底泥及生物樣品分別取15 mg， 加入2 mL預冷的0.1 mol/L TCA，反復凍融并超聲波破碎后離心， 合并上清液[1]; 沉淀中加入2 mL 6 mol/L HCl于110℃水解24h后， 收集水解液。將上述各提取液氮吹至近干后， 使用Waters AccQ Tag化學試劑包進行衍生化處理[1，17]， 后經Agilent 1290/6460 HPLC-MS/MS檢測各樣品中BMAA的濃度水平。

BMAA毒素建議安全標準限值的確定及對人體的健康風險評估參照美國國家科學院提出的健康風險評價方法[18]， 開展BMAA毒素對人體的健康風險評估。參考Spencer等[19]的獼猴急性毒性實驗數據， 確定BMAA不致引起有害健康效應最高劑量NOAEL值， 并根據公式(1-1)推算出BMAA毒素人類每日容許攝入量TDI值， 根據公式(1-2)計算養殖水產品BMAA毒素的估計每日攝入量EDI值， 根據公式(1-3)確定淡水養殖產品BMAA毒素建議安全標準限值GV; 通過EDI與TDI、BMAA濃度與GV值的比較， 評估淡水養殖產品中的BMAA毒素對人體健康存在的潛在風險。

式中，NOAEL取值100 mg/(kg·d);UF是不確定系數，取值1000;BW是國際人體身體平均質量， 取值60 kg(成人)或20 kg(兒童);AF是分配系數， 取值0.2;C是水產品體內總BMAA濃度， 單位為μg/g干重;A是日常暴露量， 取值100 g干重/d。

1.2 新型化感緩釋抑藻劑的制備及其調控BMAA污染的效果研究

新型化感緩釋抑藻劑的制備稱取適量氧化石墨烯(GO， 圖2a)溶于水， 超聲波震蕩混合均勻后依次加入1.2 g氫氧化鈉和0.8 g氯乙酸， 并用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺溶液和N-羥基硫代琥珀酰亞胺溶液活化GO 1h。向上述混合液中加入適量L-半胱氨酸鹽酸鹽并孵育12h， 透析后冷凍干燥得到修飾后的氧化石墨烯(Cys-GO， 圖2b)粉末[20]。稱取適量沒食子酸和Cys-GO粉末溶于水，用磁力攪拌器混合均勻后加入適量海藻酸鈉并運用超聲波輔助震蕩制備分散液， 用注射器移取分散液滴入10% CaCl2溶液中固化成鈣凝膠球后， 取出并用超純水清洗3次， 于40℃烘箱內干燥得到新型化感緩釋抑藻劑。

圖2 GO(a)與Cys-GO(b)的掃描電鏡圖Fig. 2 Scanning electron microscopic images of GO (a) and Cys-GO (b)

新型化感緩釋抑藻劑調控BMAA污染的效果研究供試藻種選用產毒藍藻“銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa， FACHB-315)”， 購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫， 采用BG-11培養基擴大培養， 培養方法參考劉菲菲等[21]。根據前期開展的抑藻能力測試結果發現， 當沒食子酸濃度為12.5 mg/L時制備的化感緩釋抑藻劑具有較強的抑制產毒藍藻生長的能力， 故后續的抑藻劑調控BMAA污染及其生態安全性評價均采用此濃度開展研究。通過比較分析上述化感緩釋抑藻劑添加前后銅綠微囊藻培養液中胞內BMAA、胞外BMAA及BMAA總量的變化情況， 以此闡明抑藻劑對BMAA毒素污染的調控效果。具體步驟如下: 分別定量采集抑藻劑添加前后的受試藻液， 離心并冷凍干燥處理， 按照上述生物樣品處理方法進行處理并檢測各組胞內BMAA含量， 按上述水樣處理方法處理并檢測各組胞外BMAA含量， 同步測定藻細胞質量濃度(ρ)， 并按照公式(1-4)計算各組BMAA總含量。

式中，C1是單位質量細胞內BMAA含量， 單位為μg/g干重;ρ是培養液的藻細胞的質量濃度， 單位為g干重/mL;V是培養液體積， 單位為mL;C2是胞外BMAA的含量， 單位為μg/mL。

1.3 新型化感緩釋抑藻劑的生態安全性評價

參考GB/T 16125-2012《大型溞急性毒性實驗方法》[22]和GB/T 13267-1991《物質對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定方法》[23]選育受試對象。以重鉻酸鉀為參考毒物測試大型溞和斑馬魚的敏感性， 分別設置新型化感緩釋抑藻劑實驗組及空白對照組，平行3次。實驗連續觀察48h， 記錄受試生物活動或死亡情況， 計算存活率(%)并評價其生態安全性。

1.4 數據統計與分析

所有樣品平行測定3次， 所得數據采用平均數±標準差(mean±SD)表示。利用Excel 2016和Origin 2018進行數據分析和繪圖。用SPSS 25.0軟件對實驗數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 淡水池塘養殖池塘中BMAA的污染水平

根據養殖池塘水體、底泥、養殖產品(河蜆、銅銹環棱螺、日本沼蝦、中華絨螯蟹、青魚、鯽)樣本內BMAA含量的HPLC-MS/MS檢測結果(圖3)，初步闡明了BMAA在淡水養殖池塘中的污染分布情況及其含量水平(表1)。

圖3 淡水池塘養殖池塘中水體、底泥以及6種水產品的BMAA色譜圖Fig. 3 BMAA chromatogram of water， sediment and six kinds of aquaculture products in freshwater aquaculture ponds

結果表明， 本實驗所選取的軟體動物(河蜆、銅銹環棱螺)檢測到的BMAA平均含量是甲殼動物(日本沼蝦、中華絨螯蟹)含量的1.56倍， 是雜食性魚類(青魚、鯽)含量的1.85倍; 藍藻暴發時期6種水產品中銅銹環棱螺體內的BMAA富集程度最高， 約為同時期河蜆體內BMAA含量的2倍。由此可知，BMAA毒素在本文所調查的淡水養殖環境和生物體內均有一定程度的污染， 且具有生物累積效應。

2.2 淡水養殖產品中BMAA的健康風險評估

TDI值 根據Spencer等[19]的獼猴急性毒性實驗數據， 確定BMAA的不致引起有害健康效應最高劑量NOAEL值為100 mg/(kg·d)， 設置不確定系數(UF)為種間差異10， 種內差異10， 數據庫限制10， 根據上文公式(1-1)可推算出BMAA毒素的TDI值為100 μg/(kg·d)。

EDI值根據樣品中BMAA的含量及公式(1-2)， 可計算出6種淡水養殖產品BMAA的估計每日攝入量EDI值(表2)。通過考察成人和兒童兩種情況均發現: 上述6種水產品中BMAA的EDI值均遠小于TDI值(圖3)。參照美國國家科學院提出的健康風險評價方法[18]， 若EDI值大于TDI值， 則認為被BMAA毒素污染的淡水養殖產品是不安全的， 反之則可認為安全。因此可以認為本實驗所調查的6種淡水養殖產品雖已被BMAA毒素污染， 但目前尚處于安全水平。

表2 6種淡水養殖產品成人和兒童的EDI值Tab. 2 EDI values of six freshwater aquaculture products for adults and children

GV值根據公式(1-3)， 可計算出淡水養殖產品BMAA的建議安全標準限值(GV): 成人為12 μg/g、兒童為3 μg/g。結合表1中6種淡水養殖產品中BMAA的含量及圖4中BMAA含量與GV值的關系圖， 可以發現本文選取的6種淡水養殖產品中的BMAA含量均遠低于成人和兒童BMAA的GV值。

圖4 BMAA含量和EDI值(成人、兒童)、TDI值、GV值(成人、兒童)之間的關系圖Fig. 4 The relationships between BMAA contents， EDI values(adults， children)， TDI values and GV values (adults， children)

表1 淡水池塘養殖池塘中BMAA的含量Tab. 1 Contents of BMAA in freshwater aquaculture ponds

2.3 新型化感緩釋抑藻劑調控BMAA污染的效果

對12.5 mg/L新型化感緩釋抑藻劑投放前后銅綠微囊藻受試藻液中的胞內、胞外BMAA含量及藻細胞質量濃度進行分析檢測， 并計算BMAA總量(表3)。

表3 新型化感緩釋抑藻劑添加前后銅綠微囊藻受試藻液中BMAA含量的變化Tab. 3 Changes of BMAA content in the algae solution of M.aeruginosa before and after adding new allelopathic sustainedrelease algae inhibitors

結果表明， 新型化感緩釋抑藻劑投放前后受試藻液的胞外BMAA含量都非常低， 雖略有增加但是差異不顯著(P＞0.05)， 由此可知， 抑藻劑的添加對銅綠微囊藻BMAA毒素的釋放無顯著影響; 抑藻劑添加7d后胞內BMAA含量出現顯著下降， 而胞外BMAA增加不明顯， BMAA總量下降69.72%。綜上所述， 12.5 mg/L新型化感緩釋抑藻劑對BMAA毒素污染具有較好的調控效果。

2.4 新型化感緩釋抑藻劑的生態安全性評價

新型化感緩釋抑藻劑的生物急性毒性測試結果表明， 新型化感緩釋抑藻劑投放濃度為12.5 mg/L時， 大型溞的24h存活率仍可達70%， 斑馬魚的48h存活率達到80%。由此可知， 本文所研發的新型化感緩釋抑藻劑在保證較好調控藻毒素污染效果的同時還具有良好的生態安全性。

3 討論

3.1 淡水養殖池塘中BMAA的污染水平及其健康風險評估

據報道， BMAA毒素在水生動物中存在生物富集和生物放大等現象。Brand等[6]在調查佛羅里達州卡盧薩哈奇河中BMAA污染情況時發現， 貽貝(Mytilus edulis)、弓鰭魚(Amia calva)、鱷雀鱔(Atractosteus spatula)、大嘴鱸(Largemouth bass)等水生生物中BMAA的累積濃度達到250—2559 μg/g FW; Mondo等[24]調查了南佛羅里達7種鯊魚魚翅中BMAA的富集情況， 結果發現其濃度介于144—1836 ng/mg FW。BMAA沿“藍藻-蘇鐵-果蝠”這一食物鏈的傳遞過程中， 其濃度被放大了1萬倍以上[3，4]; 在波羅的海區域生態系統中， 浮游動物體內BMAA含量比它們的食物-藍藻平均增加6倍， 在一些魚類的組織中， BMAA含量被放大200倍[25]。本實驗研究結果表明， BMAA毒素在所調查的6種典型淡水養殖產品中的濃度介于0.363—1.040 μg/g FW， 遠低于上述研究的BMAA污染水平， 這可能是由于人工養殖環境下的淡水養殖產品主要食物來源為飼料餌料等， 食物鏈結構相對比較簡單， 從而養殖生物體內通過食物鏈途徑積累和富集的BMAA毒素要遠低于自然條件下生長的水生生物。

WHO等國際組織和多數國家均未對BMAA開展健康風險評估工作， 導致BMAA的相關限量標準缺失。根據Roney等[26]的研究推測， 中國居民接觸到BMAA毒素最可能的途徑是食用受BMAA污染的水產品， 但是我國目前尚未制定關于BMAA的淡水養殖產品質量安全的標準限值。本實驗的研究結果表明， BMAA毒素在所調查的淡水養殖環境和生物體內均有一定程度的污染， 且具有生物累積效應。6種淡水養殖產品中BMAA的EDI值(估計每日攝入量)均遠小于TDI值(每日容許攝入量)， 其濃度水平也遠低于GV值(建議安全標準限值: 成人12 μg/g、兒童3 μg/g)， 對人體的健康風險較低。但是考慮到本研究中實驗樣品的采集區域有限， 需要在今后的工作中繼續驗證研究結果的準確和可靠性。

3.2 化感緩釋抑藻劑對BMAA毒素污染的調控效果及其生態安全性

BMAA化學性質穩定， 不易分解， 并且國內外針對BMAA毒素去除技術的研究也鮮有報道。Esterhuizen等[27，28]采用沉積物物理吸附和大型水生植物吸收BMAA等方式降低水體中BMAA毒素的污染水平， 但是沉積物吸附的BMAA極易轉移至底棲動物而被其他水生動物捕食， 受BMAA污染的大型水生植物也可被魚類直接攝食， 故均不宜用于淡水養殖生態系統中BMAA毒素的去除。利用化感物質對產毒藍藻生長進行抑制， 進而從源頭上減少BMAA毒素的產生與釋放可作為一種調控淡水養殖生態系統中BMAA毒素污染較為切實有效的方法。但是必須注意到， 在養殖水體中直接投放化感物質容易造成局部濃度過高而對其他水生生物產生不利影響， 同時抑藻的有效時間也大大縮短[29，30]。為此， 使用具有緩釋功能的化感抑藻劑可避免上述弊端的發生。劉振宇和劉彬[31]的研究發現， 使用青蒿素和殼聚糖/海藻酸鈉制成的緩釋體膠囊的抑藻有效時間比純青蒿素增加了54%; 黃皓旻[9]制備的黃酮仿生化感抑藻劑可持續釋放化感物質的時間長達120d。本文研發的新型化感緩釋抑藻劑能有效調控BMAA毒素污染， 添加12.5 mg/L抑藻劑7d后銅綠微囊藻的胞內BMAA含量顯著下降， 胞外BMAA無明顯增加， BMAA總量也隨之明顯減少。可見產毒藍藻(銅綠微囊藻)在適當劑量的化感緩釋抑藻劑的脅迫下其胞內BMAA毒素的合成受到了一定程度的抑制， 并且不會促進胞外BMAA毒素的釋放， 從而有效降低BMAA毒素總量， 對BMAA污染具有良好的調控效果。

作為植物的次生代謝產物， 化感物質在投加過程中是否會對環境產生一定的副作用， 尤其是對水環境中其他水生生物的生態安全性也亟須研究明確。張庭廷等[32]研究發現， 一種名為“對羥基苯甲酸”的化感物質以最佳抑藻濃度0.8 mmol/L作用于鯉(Cyprinus carpio)后， 通過對魚鰓、肌肉、肝臟及血液等多種生化指標分析證明， 對羥基苯甲酸在該濃度下對鯉無明顯的毒性作用; 鄭春艷等[33]研究了3種化感物質(亞油酸、水楊酸和對羥基苯甲酸)對多刺裸腹蚤(Moina macrocopa straus)的毒性作用，結果發現， 亞油酸對多刺裸腹蚤屬于高毒， 水楊酸及對羥基苯甲酸屬于低毒。本研究開發的新型化感緩釋抑藻劑投放濃度為12.5 mg/L時， 未對大型溞和斑馬魚產生明顯的毒性效應。由此可知， 本文所研發的新型化感緩釋抑藻劑在保證較好抑藻效果的同時還具有良好的生態安全性， 可應用至實際淡水養殖池塘產毒藍藻水華治理中。

4 結論

(1) BMAA毒素在本文所調查的淡水養殖環境和生物體內均有一定程度的污染， 具有生物累積效。(2)本文所調查的6種淡水養殖產品中BMAA的EDI值遠低于TDI值， BMAA濃度水平也遠低于成人與兒童的BMAA建議安全標準限值(GV)， 因此可認為其對人體的健康風險較小。(3)新型化感緩釋抑藻劑在有效降低BMAA毒素污染水平的同時兼具良好的生態安全性， 可應用至實際養殖池塘產毒藍藻及藻毒素污染的防治工作。