營養缺失對具鞘微鞘藻胞外多糖和糖原分配模式的影響

葛紅梅 周雅茹 柳詩鶯 王賢哲 韓興燁 汪淑廉 胡春香

(1. 湖北工業大學河湖生態修復與藻類利用湖北省重點實驗室， 武漢 430068; 2. 中國科學院水生生物研究所， 武漢 430072)

34億年前， 藍藻是地球上唯一的光合自養生物，當今， 它仍然是很多生境中非常重要的光合植物類群， 特別是作為嚴酷貧瘠生境中最早的初級生產者，對地球生態系統的形成和演化起著非常重要的作用。而它成功拓殖的根源很大部分來自細胞外的胞外多糖(Exopolysaccharides， EPS)， 因這部分的存在大大提高了藍藻抵抗干旱、輻射、風沙和鹽堿等多種脅迫的能力[1，2]。

藍藻光合作用的初級產物大多數是糖原[3]。雖然糖原不僅調節胞內碳濃度、抵御饑餓[4]， 還具有抵抗鹽脅迫和氧化損傷的功能[5]， 但為了抵御和適應多種脅迫環境， 藍藻還分配相當的能量到胞外，特別地形成由緊密結合的莢膜多糖(Capsular polysaccharides， CPS)和松散結合能分泌到周圍環境中的釋放多糖(Released polysaccharides， RPS)構成的EPS。而且由于糖原[6]和EPS[7，8]誘人的工業應用前景， 大量研究都只關注其中一方的積累， 僅少量研究探討了藍藻糖原和EPS在同一培養條件下的變化規律， 如Ge等[9]研究發現光照強度明顯影響具鞘微鞘藻細胞內糖原與胞外EPS的分配格局; Myriam等[10]通過文獻調研和統計分析， 推斷出光強、溫度、高鹽和氮限制是能影響鈍頂節旋藻(Arthrospira platensis)EPS和糖原合成和分泌的環境因子， 其中光強的影響作用最明顯， 而并未在實驗條件下研究鈍頂節旋藻在同一培養條件下藻細胞中碳流在糖原/EPS代謝生物合成途徑中的分配。大量研究發現， 氮限制[6]、光[6，7，9]、鹽[3]和重金屬[8]脅迫等逆境環境明顯刺激藍藻EPS的分泌或糖原的合成， 在沙漠環境中， 營養元素的匱乏是極其常見的。基于此，本文以分布在生物土壤結皮中的藍藻優勢種具鞘微鞘藻(Microcoleus vaginatusGomont)為實驗材料，研究其在不同營養元素缺失條件下細胞胞外EPS和胞內糖原合成的規律， 以探究具鞘微鞘藻胞外多糖和糖原代謝合成過程中碳流分配規律， 從而深入了解結皮藍藻抵抗逆境的機制。

1 材料與方法

1.1 藻種及其培養

具鞘微鞘藻(FACHB-896)購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫， 最初分離自騰格里沙漠沙坡頭試驗站的生物結皮中。M. vaginatus在10 L BG-11[11]培養基中通氣培養， 收集藻體， 并用蒸餾水清洗3遍后轉接到含50 mL培養基的100 mL的錐形瓶中。培養基為分別缺失NO3-、PO43-、Mg2+、Ca2+和Fe2+離子的BG-11及BG-11; BG-11培養基為對照， 缺失NO3-、PO43-、Mg2+、Ca2+和Fe2+離子的培養基分別為BG-11中未加入NaNO3、K2HPO4、MgSO4、CaCl2和檸檬酸鐵銨等化合物。藻種和實驗藻體都在25℃(±1℃)， 40 μE/(m2·s)單側白質光連續光照培養。每個處理設3個平行， 每瓶每天手動搖4次。

1.2 生物量測定

在培養第4和第8天取樣， 每次取樣20 mL， 藻體用蒸餾水清洗1遍后， 8000×g離心4min， 真空冷凍干燥(Christ ALPHA 1-2 LD plus， German)后稱重。

1.3 光系統Ⅱ(PSⅡ)的最大光合效率(Fv/Fm)的測定

取2 mL藻液， 暗適應15min后， 然后用便攜式植物效率分析儀(PEA， Hansatech ， UK)測定其光合活性。最大熒光時的飽和脈沖為1500 μE/(m2·s)。

1.4 葉綠素a含量的測定

葉綠素a含量的測定參照Lan等[12]的方法， 稱取一定的干樣， 然后置于研缽中， 在避光條件下，80%的丙酮溶液中研磨藻細胞， 4℃冰箱中避光放置一夜， 離心后測定上清液在663、490和384 nm波長下的吸光值。按公式葉綠素a含量=1000×(1.02×A663-0.0.027×A384+ 0.01×A490)/92.5 計算， 單位mg/g。

1.5 糖的測定

收集藻細胞后的培養基用于測定釋放的多糖(Released polysaccharides， RPS)的含量[13]; 細胞莢膜多糖(Capsular polysaccharides， CPS)含量的測定參照葛紅梅等[14]的方法， 將稱重干藻加蒸餾水于80℃水浴6h， 離心(3000×g， 15min)后， 上清液用分子截留量3500 D的透析袋透析2d， 然后測定糖含量。總的胞外多糖(Extracellular polysaccharides， EPS)是RPS和CPS含量的總和。細胞內總糖的測定參照葛紅梅等[14]的方法進行。RPS、CPS和細胞內總糖的定量測定均用苯酚硫酸法進行[15]。

糖原的測定參照Ge等[9]的方法， 將干藻樣用80%乙醇清洗， 加入蒸餾水于120℃高壓1h， 用α淀粉葡糖苷酶于57℃過夜， 然后按照測定葡萄糖的方法進行[16]。

1.6 數據分析

實驗數值是3個平行的平均值， 數據利用Oneway ANOVA 進行方差分析， 在SPSS 18.0軟件上進行。P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

2 結果

2.1 營養缺失對生長的影響

如圖1所示， 無論是在第4還是第8天，M. vaginatus在分別缺NO3-和Mg2+培養基的生物量明顯低于對照(全營養培養基;P＜0.05)， 而在分別缺少Ca2+和Fe2+培養基中的生物量與對照的幾乎相同(P＞0.05; 圖1); 在缺 P O34-培養基中的生物量在第8天時明顯低于對照(P＜0.05)。

圖1 營養缺失對具鞘微鞘藻生物量的影響Fig. 1 Effects of nutrient deficiency on biomass of M. vaginatus

2.2 營養缺失對Fv/Fm和葉綠素a含量的影響

如圖2所示， 在培養的第4和第8天， 在缺NO3-的培養基中，M. vaginatusPSⅡ的最大光合效率(Fv/Fm)明顯高于對照(P＜0.01)， 缺PO43-培養物的Fv/Fm值明顯低于對照(P＜0.01; 圖2)， 而缺Mg2+培養物的Fv/Fm值與對照無明顯差異(P＞0.05; 圖2)。缺Ca2+或缺Fe2+培養物在第4天時的Fv/Fm值均明顯高于對照(P＜0.05; 圖2)， 而在第8天時， 與對照的無明顯區別(P＞0.05)。

圖2 營養缺失對具鞘微鞘藻Fv/Fm的影響Fig. 2 Effects of nutrient deficiency on Fv/Fm of M. vaginatus

如圖3所示， 無論是在培養的第4還是第8天， 缺NO3-或缺Mg2+的M. vaginatus培養物， 其葉綠素a含量均明顯低于其他處理(P＜0.01)， 而缺Ca2+或缺Fe2+培養物的葉綠素a含量與對照的無明顯差異(P＞0.05; 圖3)。缺PO43-培養物在培養第4天時的葉綠素a含量與對照無明顯差異(P＞0.05)， 而到第8天時， 明顯低于對照(P＜0.01; 圖3)。

圖3 營養缺失對具鞘微鞘藻葉綠素a的影響Fig. 3 Effects of nutrient deficiency on chlorophyll a of M.vaginatus

2.3 營養缺失對EPS各部分及其總量的影響

圖4a顯示了在營養缺失條件下M. vaginatus釋放到培養基中RPS的情況。與對照相比， 實驗設定的營養缺失條件并未刺激M. vaginatus釋放RPS， 相反， 第8天時， 在分別缺NO3-、PO43-、Mg2+或Ca2+培養基中的RPS量均明顯低于對照(P＜0.05)， 缺Fe2+培養基中RPS量與對照幾乎相同(P＞0.05)。

如圖4b所示， 無論是在培養的第4還是第8天，缺NO3-培養物的CPS含量明顯低于對照(P＜0.01)，而缺PO43-或缺Mg2+培養物的CPS含量均與對照無明顯差異(P＞0.05)， 缺Ca2+或缺Fe2+培養物的CPS含量均明顯高于對照(P＜0.05; 圖4b)。各處理的RPS/CPS比值都小于1， 尤其在第8天時， 分別缺NO3-、PO43-、Mg2+或Ca2+培養物的RPS/CPS比值都明顯低于對照(P＜0.01; 圖4c)， 即表明在營養缺失條件下，M. vaginatus在胞外合成EPS過程中， 優先合成CPS， 較少合成RPS。

營養缺失對M. vaginatusEPS的影響如圖4d所示。無論是在培養的第4還是第8天， 缺NO3-或缺PO43-培養物合成的EPS量均明顯少于對照(P＜0.01)，而缺Mg2+、Ca2+或Fe2+培養物的EPS量均與對照無明顯差異(P＞0.05; 圖4d)。

圖4 營養缺失對具鞘微鞘藻RPS、CPS、RPS/CPS、EPS的影響Fig. 4 Effects of nutrient deficiency on RPS， CPS， RPS/CPS and EPS of M. vaginatus

2.4 營養缺失對細胞內總糖的影響

圖5顯示了在營養缺失條件下M. vaginatus細胞內總糖的情況。在培養第4天時， 各處理間的細胞內總糖無明顯區別(P＞0.05); 到第8天時， 缺NO3-培養物胞內總糖含量明顯高于其他各處理組(P＜0.01)， 而缺PO43-、Mg2+、Ca2+或Fe2+培養物的胞內總糖含量均與對照無明顯差異(P＞0.05; 圖5)。

圖5 營養缺失對具鞘微鞘藻細胞內總糖的影響Fig. 5 Effects of nutrient depletion on total intracellular carbohydrate of M. vaginatus

2.5 營養缺失對糖原的影響

圖6顯示了在營養缺失條件下M. vaginatus合成糖原的情況。與對照相比， 無論是在培養的第4還是第8天， 缺NO3-、PO43-、Mg2+或Ca2+等營養鹽均明顯促進了M. vaginatus體內糖原的合成(P＜0.01)， 而缺Fe2+直到第8天時才明顯促進了糖原的合成(P＜0.01)。

圖6 營養缺失對具鞘微鞘藻糖原的影響Fig. 6 Effects of nutrient depletion on glycogen of M. vaginatus

2.6 營養缺失對EPS/糖原比值的影響

如圖7所示， 無論在培養的第4還是第8天， 缺NO3-、PO43-、Mg2+或Ca2+的培養物其EPS/糖原比值在1.7—8.0， 且明顯低于對照組(P＜0.01)， 而隨著培養時間的延長， 各培養條件下EPS/糖原比值基本無變化(P＞0.05)。

圖7 營養缺失對具鞘微鞘藻EPS/糖原比值的影響Fig. 7 Effects of nutrient depletion on the ratio of EPS/glycogen in M. vaginatus

3 討論

3.1 營養缺失對生長的影響

氮、磷、鎂、鈣等大量元素及鐵等微量元素是非固氮藻類生長必需的營養元素， 當某種元素長期缺乏時， 生物體的生長和生理功能則受到一定抑制[17，18]。在本研究中， 缺NO3-、PO43-或Mg2+明顯影響了藻體的生長和葉綠素a的合成， 而Ca2+或Fe2+的缺乏則對這兩項指標無明顯影響。氮和鎂是葉綠素的主要組成元素， 因而可能對該藻的生長和葉綠素a合成影響更為明顯， 而藻細胞內鈣和鐵元素在短時期內能滿足自身生長和葉綠素a合成的需求。

3.2 營養缺失對EPS分泌的影響

有研究發現， 影響藍藻EPS分泌的主要營養元素包括可利用的碳、氮、磷和硫[19，20]， 其中碳和氮主要通過調節胞內的碳氮比例而影響EPS的分泌，即當碳氮比大于一定閾值時， 藻細胞向外分泌EPS[19，21]。一般氮限制因抑制藻類的生長， 造成體內碳的過剩， 而明顯促進藍藻EPS的分泌[19，21]。在多數情況下， 缺磷、低磷或缺硫條件可以刺激藍藻胞外多糖的釋放[22，22]。一般而言， 磷濃度的增加基本不影響胞外多糖的產量。鹽濃度(NaCl)的增加促進EPS的分泌與藻細胞通過分泌EPS抵抗環境逆境有關[13，23]。我們的研究結果發現， 氮缺乏明顯抑制M .vaginatus分泌RPS、CPS和EPS， 且限制了其生長， 這與以前的大多數研究結果相反， 但與Tiscner和Davis等[24]的研究結果相同。這可能是因為氮是M. vaginatus生長和體內物質合成的重要元素， 缺乏氮素時， 細胞內蛋白合成受到限制， 但胞內碳含量并未過剩， 將有限的能量用于生長和體內代謝等， 但不向外分泌RPS， 則就明顯抑制了EPS的分泌。磷缺乏也抑制M. vaginatusRPS和EPS的分泌，與以前在魚腥藻Anabaenaspp.、膠鞘藻Phormidiumsp.和曲殼藻Achnanthes brevipes中研究結果相似[25，27]。鎂、鈣或鐵缺乏既不影響M. vaginatusEPS的分泌， 也不影響其生長， 這與在2種藍桿藻Cyanothece16Som2和C.closterium中發現的結果相似[22，27]。這些結果說明EPS的分泌受培養基中不同營養元素的影響。氮、磷、鎂、鈣或鐵的缺乏并未刺激M. vaginatus總EPS的分泌， 很可能是由于細胞傾向將能量優先存儲在體內， 幫助其抵抗營養缺失時的不良環境， 使碳流較少向外輸出。

3.3 營養缺失對RPS和CPS分配模式的影響

藍藻的EPS是由緊密結合的CPS和松散結合的RPS組成， 它們對細胞的功能和重要性上也是有偏重[28]， 合成膠鞘有利于保護藻細胞[29]， 而分泌RPS是為改善細胞外界的環境， 如增加周圍環境中有機碳含量和酶活性[1]。以前研究發現， 水華藍藻Microcystis aeruginosa[30，31]在生長過程中分泌的EPS中以CPS為主， Nicolaus等[26]研究發現一些藍藻以CPS為主， 而一些藍藻以RPS為主。在我們的研究中， 與對照相比，M. vaginatus在營養元素缺失條件下， 在向胞外分泌的EPS中， 分泌更多的CPS， 而較少分泌RPS。這說明在營養元素受到限制時，M.vaginatus將有限的能量優先合成利于自身生存的CPS。這種經濟合理的能量分配模式將十分有利于其在貧瘠沙漠地區生存。

3.4 營養缺失對糖原合成的影響

目前， 外界環境因素對糖原合成的影響已有很多報道， 主要集中在營養條件和培養條件方面。在藍藻中， 當營養缺失抑制細胞生長時或突然增加能量輸入時， 糖原會大量積累[4，5，32]。氮限制會明顯促進藍藻糖原的積累[4，5，33]。磷、硫磷限制同樣會促進極大節旋藻Arthrospira maxima體內糖原的積累[33]。有研究發現高鹽濃度同樣會明顯促進極大節旋藻Synechococcus elongatusPCC 7942和集胞藻Synechocystissp. PCC 6803糖原的積累[4，5]。在我們的研究中， 氮和磷缺乏也明顯促進了藍藻體內糖原的積累， 而且發現鎂、鈣或鐵缺乏也明顯促進糖原的合成， 尤其是氮或鎂缺乏對糖原合成促進作用最明顯。可能是因為氮和鎂限制明顯抑制了M. vaginatus的生長和葉綠素a的合成， 而光合活性并未受到抑制， 將過剩的碳用于體內糖原的積累， 因而氮和鎂缺乏時的促進糖原合成作用最明顯。而磷的缺乏限制了M. vaginatus的生長， 但對葉綠素a的合成沒影響， 鈣和鐵的缺乏對M. vaginatus的生長和葉綠素a的合成都無明顯影響， 因而磷、鈣和鐵的缺乏對糖原的積累作用要弱些。這些結果說明在短暫營養缺失條件下， 細胞會存儲能量物質， 但不同的營養離子限制對其累積作用是有差異的。這些結果進一步表明糖原含量的增高可能與其抵抗逆境環境有關。

3.5 營養缺失對EPS和糖原分配模式的影響

在營養缺失時， 具鞘微鞘藻傾向存儲糖原， 但仍將高于合成糖原的碳流用于合成EPS。尤其在氮缺乏時， EPS/糖原值最小， 細胞內總糖含量最高， 細胞分配能量更經濟。營養缺失明顯影響具鞘微鞘藻EPS和糖原的分配格局， 這種能量分配模式可能十分有利于其在貧瘠沙漠地區生存。

4 結論

(1) NO3-、PO43-或Mg2+缺乏明顯抑制了M. va-ginatus的生長和葉綠素a的合成(P＜0.05)， 而Ca2+或Fe2+缺乏則這兩個指標無明顯影響(P＞0.05)。(2)氮、磷、鎂、鈣或鐵的缺乏均未刺激M. vaginatus總EPS的分泌(P＞0.05)， 而明顯促進了糖原的合成(P＜0.01)。營養缺失明顯影響了該藻在合成EPS和糖原方面的能力和物質分配， 細胞傾向將固碳產物以糖原形式存儲在體內， 幫助其抵抗營養缺失時的不良環境。(3)營養缺失時，M. vaginatus在合成EPS的過程中， 將有限的能量優先分配用于合成利于自身生存的CPS， 較少向外分泌RPS， 這種經濟合理的能量分配模式將十分有利于其在貧瘠沙漠地區生存。(4)營養缺失明顯影響具鞘微鞘藻EPS和糖原的分配模式， 這種能量分配模式可能十分有利于其抵抗貧瘠沙漠環境。