依托泊苷脂質微球注射液熱原及細菌內毒素檢查方法

孫 丹

遼寧省檢驗檢測認證中心遼寧省藥品檢驗檢測院藥理室，遼寧沈陽 110036

依托泊苷是肺癌患者臨床化學治療的重要一線藥物，尤其針對廣泛期、預后較差的小細胞肺癌，其聯合順鉑方案的治療有效率高，已沿用數十年。市售依托泊苷一般會具有骨髓抑制等明顯不良反應，并且水中的溶解度差（溶解度為58.7 mg/L）[1-2]，常會誘發刺激等不良反應[3]。最近幾年來逐步開展的有關依托泊苷脂質體類藥物新劑型研究，都在力求降低該品種的毒副作用，同時最大限度保留其抗癌細胞增殖生長的相關藥效[2]。

依托泊苷脂質微球注射液包含依托泊苷、脂溶性介質、水和表面活性劑，這些成分使依托泊苷在油水兩相的界面膜中都會有一定比例的分布，從而可提高在油水均難溶的依托泊苷在乳劑介質中的穩定性和載藥量，并可降低其毒性及血管刺激性，同時可提高藥物的化學穩定性及療效，使得該制劑在臨床應用中具有高效性、低毒性和低刺激性的優勢。目前來看，國內已批準上市的脂質體注射劑類型還比較少，其產業化規模、生產工藝水平同國外相關制劑相比還有一定差距，質量控制中的熱原檢查項也未有文獻報道[4-5]。本研究通過按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則[6-7]中收載的“熱原檢查和細菌內毒素檢查法”，旨在探討依托泊苷脂質微球注射液2種藥典方法的可操作性與可行性，從而找出適用于該品種的相關檢查方法，以控制藥品質量。

1 儀器與材料

ZRY-2D智能熱原儀（天津天大天發科技公司），ET-96內毒素凝膠法測定儀（天津天大天發科技公司），vortex-5渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造公司），omh180烘箱（賽默飛世爾科技公司）。

細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-201885，規格：80 EU/支）；細菌內毒素檢查用水（BET水，湛江博康海洋生物有限公司，批號：151210，2 ml/支）；鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號： 1307031，規格：0.1 ml/支，靈敏度：0.06 EU/ml；福州市新北生化工業有限公司，規格：0.1 ml/支，批號：14111112，靈敏度：0.06 EU/ml）。依托泊苷脂質微球注射液（沈陽藥科大學，批號：20131101、20131102、20131103，規格：50 ml∶50 mg）。

日本大耳白兔，體重2.6～3.0 kg，雄雌不限，雌兔無孕，由沈陽藥科大學實驗動物中心供應，實驗動物生產許可證號：SCXK（遼）2014-0002。

2 方法與結果

2.1 熱原檢查

本品臨床最大給藥量為靜脈滴注，一日按體表面積100～150 mg/m2。參照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則中“9301注射劑安全性檢查法應用指導原則”[8]，熱原檢查設定限值可參照臨床劑量計算，樣品的注射體積每千克體重一般不少于0.5 ml，不超過10 ml。另樣品每平方米體表面積的劑量乘以0.027即可換算為每千克的體重劑量（M），故樣品臨床用量為4.05 mg/kg，熱原檢查實驗給藥體積設定為最大給藥劑量的2倍，即8 ml/kg·BW。

按《中華人民共和國藥典》2015版四部通則中“1142熱原檢查法”[6]進行實驗。取檢體溫合格的家兔，每批3只，耳靜脈注射本品，8 ml/kg·BW，給藥后測定體溫，共測定6次，每次間隔30 min，以6次測量體溫中最高溫度值減去基礎測量體溫值，即為該只家兔體溫升高溫度。結果表明，三批樣品中每只家兔體溫升高值均低于0.6 ℃，3只家兔的體溫升高數值總和均低于1.3℃。熱原檢查實驗結果均符合規定。見表1。

表1 依托泊苷脂質微球注射液熱原實驗結果

2.2 細菌內毒素

2.2.1 鱟試劑靈敏度復核標定根據《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則中“1143細菌內毒素檢查法”[7]，進行鱟試劑的靈敏度復核。結果顯示，2個批次的鱟試劑標定結果均在0.5～2λ之間。見表2。2個批次鱟試劑的靈敏度均符合規定。

表2 鱟試劑靈敏度復核標定（EU/ml）

2.2.2 細菌內毒素限值的確定參照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則中“9301注射劑安全性檢查法應用指導原則”[8]進行樣品細菌內毒素限值的確定。計算公式：L=K/M，其中M為人使用該制劑每千克體重每小時的最大給予劑量，本品為100 mg/m2×0.027=2.7 mg/kg，K為靜脈給藥途徑，人使用該制劑每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑品種K值為5 EU/（kg·h），L=K/M=5 EU/（kg·h）/2.7 mg/（kg·h）=2 EU/mg。

2.2.3 干擾實驗預實驗經過對體積分數為1.25%、2.5%、5%乙醇溶液的考察，結果顯示，體積分數為1.25%的乙醇對內毒素檢查方法無影響，說明在實驗過程中，要保證乙醇最后稀釋成終濃度為1.25%的乙醇溶液，才不會干擾內毒素與鱟試劑的反應。見表3。

表3 乙醇內毒素檢查法考察結果

按《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則中“1143細菌內毒素檢查法”[7]檢查。取3批樣品，使用靈敏度為0.06 EU/ml的鱟試劑。先使用60%乙醇代替內毒素檢查用水稀釋樣品原液，并在渦旋混合器上振蕩5 min，經過步驟稀釋后樣品終濃度為0.03 mg/ml（與λ=0.06 EU/ml鱟試劑相對應的稀釋液濃度）及0.06 mg/ml（用于考察）。陰性對照（NC）為細菌內毒素檢查用水，陽性對照（PC）為0.125 EU/ml內毒素溶液，樣品陽性對照（PPC）為含0.125 EU/ml內毒素的相應濃度的樣品溶液。加完樣品后，輕輕混勻，37℃±1℃保溫1 h后記錄試驗結果。見表4。結果表明，依托泊苷脂質微球0.03 mg/ml稀釋液（NPC）細菌內毒素檢查符合規定，初步確定該樣品0.03 mg/ml濃度為最大無干擾濃度。

表4 依托泊苷脂質微球注射液細菌內毒素干擾實驗預實驗結果

2.2.4 干擾試驗按《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則中“1143細菌內毒素檢查法”[7]進行干擾實驗，依托泊苷脂質微球稀釋液濃度為0.03 mg/ml。將細菌內毒素工作標準品分別用BET水和樣品稀釋液稀釋至0.125、0.06、0.03、0.015 mg/ml濃度，平行4管，同時用上述樣品稀釋液及BET水分別做平行2管陰性對照，輕輕混勻，37℃±1℃測定儀保溫1 h后，記錄實驗結果。見表5。結果表明，用上述兩個廠家鱟試劑分別進行干擾試驗，Es均在0.5～2.0λ，Et均在0.5～2.0 Es，依托泊苷脂質微球注射液0.03 mg/ml濃度稀釋液無干擾。

表5 依托泊苷脂質微球注射液的干擾實驗結果（λ=0.06 EU/ml）

2.2.5 細菌內毒素檢查樣品細菌內毒素限值擬定為：每1 mg依托泊苷脂質微球注射液中含內毒素的量應小于2 EU。按《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則中“1143細菌內毒素檢查法”[7]進行檢查。使用鱟試劑的靈敏度為0.06 EU/ml，樣品濃度為0.03 mg/ml稀釋液，陰性對照為BET水，陽性對照為0.125 EU/ml內毒素溶液，樣品陽性對照是以樣品0.03 mg/ml濃度稀釋液來稀釋0.125 EU/ml的內毒素溶液，樣品加完后，注意輕輕混勻，37℃±1℃保溫1 h并記錄實驗結果。見表6。結果表明，按照擬定標準檢驗，三批依托泊苷脂質微球注射液細菌內毒素檢查均符合設定限值規定。

表6 依托泊苷脂質微球注射液細菌內毒素檢查結果（安度斯λ=0.06 EU/ml）

3 討論

參照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則中“9301注射劑安全性檢查法應用指導原則”[8]，熱原檢查限值參照臨床使用劑量計算，對于重癥用藥、需聯合用藥的藥品，一般為人用每千克體重每小時最大給予供試品劑量的2～5倍。依托泊苷脂質微球注射液適用于與其他抗腫瘤藥物如順鉑等合用，治療支氣管肺癌及睪丸癌。也可用于惡性淋巴瘤、急性非淋巴細胞性白血病、尤文氏癌和消化道惡性腫瘤的聯合化療。故熱原檢查試驗劑量設定為8 ml/kg，相當于臨床人用劑量的2倍，從嚴保障臨床用藥安全性。

預實驗時直接使用BET水稀釋依托泊苷脂質微球注射液進行干擾預實驗，但從結果來看樣品稀釋液對鱟試劑有增強型的干擾作用。故參照文獻[9]實驗方法，以60%乙醇溶液溶解本品，再進行細菌內毒素檢查。具體操作使用0.67 ml 60%乙醇溶液加入1 ml樣品原液，振蕩5 min。接下來按照一般樣品稀釋步驟進行，即保證乙醇溶液終體積分數為1.25%。本品內毒素限值擬定為計算限值，即2 EU/mg，三批樣品的內毒素檢查結果均符合制定限值規定。但本品有干擾作用，需用60%乙醇溶解本品，同時鱟試劑中含有多種蛋白質，而乙醇則使蛋白質變性，從而干擾鱟試劑與內毒素產生凝膠反應[10]，這就決定了供試品中乙醇含量不能過高，且還需選用高靈敏度的鱟試劑才能排除干擾。

因各生產企業在鱟試劑生產過程中原料、工藝、批次、質量控制等方面的不同，本實驗前期選用不同品牌鱟試劑進行了預實驗，結果發現本研究使用的兩家鱟試劑干擾較小，適用于該品種的檢查。

和傳統熱原檢查法相比較[11-14]，細菌內毒素檢查法因其具有多種優點而被各國藥典采用，并逐步替代家兔熱原檢查法控制注射劑內毒素的相關安全性。現在已經有越來越多的藥品施行細菌內毒素檢查。但與此同時，某些中藥、抗生素、生物制品、氨基酸相關注射劑、醫療器械等品種，因其與內毒素產生的致熱協同反應或干擾作用或因樣品材料的特殊、復雜性，仍需使用家兔法對特殊樣品進行熱原控制[15]。

依托泊苷為植物成分鬼臼毒素的衍生物，臨床上主要用于小細胞肺癌、惡性生殖細胞瘤、惡性淋巴瘤、白血病等癌癥的治療。其具有廣譜抗癌癥活性及較高的治療指數，尤其對小細胞肺癌的治療效果非常好，能提高2年生存率并改善患者生存質量。但依托泊苷在臨床使用過程中最常見不良反應為Ⅲ～Ⅳ度血液學不良反應、發熱及感染，成因主要是藥理作用通過抑制拓撲異構酶Ⅱ，導致DNA結構被破壞造成永久損傷，引發腫瘤細胞凋亡而起到治療作用。故骨髓抑制為藥物的主要毒性，其中嗜中性白細胞會顯著減少。而肝臟、腎臟、心臟及神經系統的不良反應比較少[16]。需要嚴格控制藥品質量，以排除因藥品質量問題引起的發熱反應，保證臨床用藥安全。以目前對依托泊苷脂質微球的研究發展程度來看，以后必然會出現越來越多相關制劑，本研究盡早制訂其熱原、內毒素標準，為以后該品種的發展盡一份綿薄之力。