醫院研究生RT-PCR技術的“三步法”科研帶教

羅 淵 梅竹松 郭丙乾 房龍梅 王廣云

解放軍空軍特色醫學中心研究部臨床醫學實驗室，北京 100142

綜合醫院都建有科研實驗室，通過集中管理大型儀器設備，達到資源共享，提高硬件使用效率和科研效益，并為醫院醫療、教學和科研提供基礎平臺[1-2]，這也是醫院研究生開展課題工作的主要場所。隨著研究生招收規模的逐年擴大和研究型醫院的加速轉型[3-4]，在實驗室開展課題工作的研究生數量也日益增加。因此，如何提高科研帶教質量和效果是擺在醫院實驗室帶教老師面前的一道亟須解決的難題。本文以目前最常用的分子生物學技術—實時熒光定量PCR（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）技術為例，結合醫院研究生的培養目標和特點，在本實驗室多年科研帶教經驗的基礎上，深入探討涵蓋“感性認識、理性認識和深刻認識”的“三步法”科研帶教模式。

1 醫院研究生RT-PCR技術科研帶教過程中的主要問題

醫院招收的研究生大都來自醫學院校的臨床醫學專業，雖然在本科階段的課程中已學過RTPCR技術，但他們掌握知識的情況參差不齊，尤其因為缺乏實際工作經驗，易產生畏難情緒。而且，研究生學習科研技能主要是跟著實驗室老師學習，或者自己查閱工具書，又或是求助相關的網站，并且還需要自己反復消化才能吸收，整個過程不但耗時、費力，而且效率低。

以上問題導致醫院研究生的RT-PCR技術實踐能力整體偏弱，尤其是分析和處理實際問題的能力不足[5]。基于此，在多年帶教工作的實踐基礎上，本實驗室針對性地構建“三步法”科研帶教模式。

2 “三步法”科研帶教模式的目的與總體設計思路

2.1 目的

針對醫院培養研究生的特點，通過總結本實驗室多年來的有益做法和經驗教訓，并參考相關單位的情況[6-7]，深入討論醫院實驗室在研究生RT-PCR技術科研帶教中的最佳路徑，希望可以拋磚引玉，給其他實驗室帶教們一點啟發，最終讓廣大研究生受益，使他們高效完成課題工作。

2.2 總體設計思路

依照循序漸進、由淺入深和理論聯系實際的總體原則，將醫院研究生的RT-PCR技術科研帶教工作凝練為“三步法”科研帶教模式。第一步是最初的感性認識培養階段，從PCR技術發展的角度增加對RT-PCR技術的整體認識；第二步是理性認識培養階段，即在RT-PCR技術全流程帶教的基礎上，使其熟悉引物的設計原則和驗證方法，并掌握基因表達的相對定量分析；第三步是深刻認識培養階段，即經過一段時間的課題工作后，使其不但可熟練運用RT-PCR技術，而且即使遇到復雜疑難問題也能獨立分析并盡力解決。

3 “三步法”科研帶教模式的主要內容

3.1 感性認識培養階段

自1985年美國科學家Kary Mullis發明聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）以來[8]，PCR的發展和應用日新月異[9]。總體而言，PCR技術的發展經歷了三個主要階段：一是基于瓊脂糖凝膠電泳觀察結果的普通PCR技術，可進行定性或半定量的分析；二是當前應用最廣泛的RT-PCR技術，通過引入雙鏈核酸特異染料（如SYBR Green等）或熒光探針（如TaqMan MGB等）而實現定性分析、相對定量或“絕對”定量[10]；三是基于微滴化反應的數字PCR（digital PCR，dPCR）技術[11]，不需建立標準曲線即可通過泊松分布的統計處理而直接得出初始核酸的拷貝數。然而，無論何種PCR技術，其內在的基本原理都是大致一樣的，只不過不同PCR技術有各自的優缺點和側重點[12-14]。

假設PCR的擴增效率為e，可推導出循環閾值（Ct）與初始模板量的對數呈負相關線性關系，其斜率為-1/log（1+e）。在理想狀態下，PCR擴增效率為1，則該斜率為-3.322[15]。在有多個標準品的情況下，即可根據標準品濃度和各自反應的Ct值得出標準曲線。對未知樣品進行RT-PCR后也可得出相應的Ct值，從而可利用標準曲線對未知樣品進行準確定量。

3.2 理性認識培養階段

與普通PCR一樣，引物設計也是RT-PCR反應的關鍵所在[16-17]。引物可自行設計，也可直接引用相關引物數據庫中的成熟引物，還可參照國內外文獻中的引物序列。見表1。

表1 RT-PCR引物的主要來源

引物合成前需在NCBI Blast上進行檢索比對，以分析其擴增特異性；合成后仍需開展預實驗，對引物的擴增特異性和有效性進行驗證。定性分析時，只要在擴增結束前出現典型的擴增曲線和Ct值，且在排除非特異性擴增后即可認為是陽性。而相對定量分析則主要是利用2-ΔΔCt法，即對不同實驗組的樣本同時檢測目的基因和一個表達相對恒定的內參基因，相當于用內參基因對各組分別進行標準化處理后再分析目的基因在組間的相對表達變化情況[15]。見圖1。

圖1 SYBR Green RT-PCR相對定量分析流程圖

3.3 深刻認識培養階段

結合科研課題工作，進行RT-PCR技術實際應用方面的培訓，使研究生能更好地將理論知識與實踐應用密切結合，即使遇到問題也能深入分析問題并積極解決問題[18]。

常用的內參基因包括GAPDH、β-actin和β2-微球蛋白等，在正式實驗前應先確認該基因的表達不會受實驗處理過程的影響。同時，運用2-ΔΔCt相對定量分析是有前提條件的，即目標基因和內參基因的擴增效率必須大致都等于1。如果兩者擴增效率不同，則只能重新優化反應條件或修改引物使擴增效率相同后再分析，或通過標準曲線法進行絕對定量后再比較。而且，為確保實驗結果的準確和可重復，每種實驗干預都應設置至少3個獨立批次的重復實驗，而且每個批次實驗中的不同組別也應分別設置至少3個復孔，并分別提取RNA進行RT-PCR檢測，稱為生物學重復；而每一份核酸樣本也應進行至少3次重復的RT-PCR反應，稱為技術重復。此外，Bustin等學者[19-20]于2009年提出RT-PCR最低限度標準（minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments，MIQE）指南，用以規范RT-PCR相關科研工作發表文章時的信息公開。不但能更好地評估實驗方案的有效性和科學性，也有利于其他研究者能重現實驗結果。

4 小結

從本實驗室多年的科研帶教工作經驗來看，通過以上三個階段由淺入深、理論結合實際的階梯式帶教，醫學研究生動手能力的提高都很快，可快速熟練掌握RT-PCR技術的原理和操作，并能結合各自的課題方向展開實際應用。還有一點要注意的是研究生剛開始接觸科研工作，對一些基本的常規操作尚不熟練，如精密移液器的使用等細節問題，這也凸顯了技術重復的重要性。總體而言，經過扎實的“三步法”教學，研究生都能把RT-PCR技術當成基本的科研工具，即使遇到問題也能獨立進行分析并解決。隨著RT-PCR檢測技術的不斷標準化和正規化，該技術將更加規范且更具可比性，真正成為醫學研究生科研工作的好幫手。