高壓氧對去卵巢大鼠骨微結構改善及骨代謝的影響機制探究

白登彥 王 冠 張海軍 朱 濤 趙志鵬

1.甘肅省第二人民醫院骨科，甘肅蘭州 730000；2.西北民族大學附屬醫院骨科，甘肅蘭州 730000

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）在臨床上大多是由于骨量減少和骨微結構改變有關，世界衛生組織（WTO）將OP定義為骨微機構損傷，骨量持續減少導致骨脆性變高的臨床骨病。美國國立衛生研究院（NIH）提出OP是骨強度降低引發的高風險性的骨骼臨床疾病。OP在一定程度上能夠減少骨載荷承受力、骨脆性增加，增加骨折發病風險和各種慢性的疼痛[1]。在免疫系統、神經內分泌系統等多組織和器官的協作下，導致OP的發生。臨床診斷中，骨量減少、骨代謝標志物減少都是診斷OP的標準。研究表明[2]，高壓氧療可能對骨微結構改善及成骨細胞生成有一定促進作用，但具體機制仍不明確。本次實驗通過研究去卵巢大鼠OP模型，在高壓氧的干預措施下，旨在探究高壓氧對去卵巢大鼠骨代謝平衡的影響機制。

1 資料與方法

1.1 動物

選取30只SPF級Wistar雌性大鼠[購自甘肅中醫藥大學實驗動物中心，合格證號：SCXK（甘）2020-0001]，體重（170±20）g，同等條件下喂養1周后進行OP造模。本實驗經本院動物實驗倫理委員會批準通過。

1.2 藥品及試劑

BALP ELISAKit（批號：E201902）、CBF-α1 ELISAKit（批號：E201906）、E2 ELISAKit（批號：E201908）、CTX-I ELISAKit（批號：E201906）、PINP ELISAKit（批號：E201905）、OC ELISAKit（批號：E201901） ，北京方程生物有限公司生產。

1.3 儀器

微型實驗動物CT影像系統（西門子，德國）；骨密度儀（韓國，型號： EXA-PRESTO） ；酶聯免疫檢測儀（BIO-RAD，美國）；高壓氧艙（上海七零一所）。

1.4 動物分組與造模

將30只大鼠隨機分成空白組、模型組、高壓氧組，每組大鼠各10只。空白組不進行任何干預，其他兩組大鼠通過去卵巢法建立骨質疏松模型大鼠[3]。造模成功后，高壓氧組大鼠每天進行高壓氧療30 min，艙壓固定為0.25 MPa，吸純氧。三組大鼠其余飼養條件等相同，持續干預4周。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 骨代謝標志物BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PⅠNP、OC、E2含量測定大鼠處死后心臟取血2 ml，設置離心R為10 cm，轉速3000 r/min，離心10 min，取上清液，ELISA法檢測血清中雌二醇E2、核結合因子-α1（core binding factor-α1，CBF-α1）、骨特異性堿性磷酸酶（Bone specific alkaline phosphatase，BALP）、Ⅰ型 膠 原 羧 基 末 端 肽（Cterminal type Ⅰcollagen telopeptide，CTX-Ⅰ）、Ⅰ型前膠原氨基端前肽（procollagen typeⅠamino-terminal peptide，PⅠNP）、骨鈣素（osteocalcin，OC）含量水平。

1.5.2 骨微結構及骨密度測定大鼠腹主動脈取血，分離大鼠右側股骨，對股骨干骺端進行CT掃描，CT參數設定為：65 kV，384 mA，分辨率18 μm。掃描完成后三維重組感興趣區域（region of interest，ROI），提取骨微結構重建圖，骨骼分析軟件Advanced Bone Analysis（ABA）對骨微結構參數包括相對骨體積分數（BV/TV）、骨小梁數量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、連接密度（Conn.D）、骨結構模型指數（SMI）及骨密度（BMD）進行計量學分析。

1.6 統計學方法

應用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，所有計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（oneway- ANOVA），兩組間比較采用χ2檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠骨密度及骨代謝標志物比較

與空白組比較，大鼠造模成功后模型組BMD及BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PⅠNP、OC、E2含量顯著降低（P＜ 0.05）；高壓氧干預4周后，與模型組對比，高壓氧組大鼠BMD、BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PⅠNP、OC、E2含量不同程度升高（P＜ 0.05）。見表1。

表1 各組大鼠BMD及骨代謝標志物含量比較（±s）

表1 各組大鼠BMD及骨代謝標志物含量比較（±s）

注 與空白組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05；BMD：骨密度，BALP：骨特異性堿性磷酸酶，CBF-α1：核結合因子-α1，CTX-Ⅰ：Ⅰ型膠原羧基末端肽，PⅠNP：Ⅰ型前膠原氨基端前肽，OC：骨鈣素，E2：雌二醇

2.2 各組大鼠骨小梁微結構比較

與空白組比較，造模后模型組大鼠骨相對骨體積分數（BV/TV）、骨小梁數量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、連接密度（Conn.D）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、結構模型指數（SMI）均出現不同程度改變（P＜ 0.05）；高壓氧干預4周后，與模型組對比，高壓氧組大鼠BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D、Tb.Sp、SMI參數發生不同程度改變（P＜ 0.05），骨強度及彈性顯著增加。見表2。

表2 各組大鼠骨小梁微結構參數比較（±s）

表2 各組大鼠骨小梁微結構參數比較（±s）

注 與空白組比較，*P ＜ 0.05，與模型組比較，△P ＜ 0.05，BV/TV：相對骨體積分數、Tb.N：骨小梁數量、Tb.Th：骨小梁厚度、Tb.Sp：骨小梁分離度、Conn.D：連接密度、SMI：骨結構模型指數

組別 n BV/TV（%） Tb.N（cm-1） Tb.Th（μm） Conn.D（cm-3） Tb.Sp（cm-1） SMI空白組 10 1.341±0.01 10.321±0.51 60.042±9.82 125.032±9.26 1.643±0.01 1.601±0.03模型組 10 1.062±0.03* 5.420±0.07* 33.870±9.01* 79.156±9.37* 3.061±0.32* 3.520±0.02*高壓氧組 10 1.203±0.05△ 8.731±0.32△ 41.390±10.37△ 98.311±10.84△ 1.980±0.02△ 2.713±0.12△F值 17.642 16.155 10.862 12.317 13.161 10.552 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

導致OP的成因與很多學說相關，微循環障礙、代謝異常、基因多態性等因素密切相關[4-5]。伴隨經濟社會發展，老齡化趨勢隨人口數量激增越來越明顯，這也導致OP的發病率增加，由其導致的骨折風險也越來越高。

高 壓 氧 療（hyper bari coxygen therapy，HBO）是一種輔助治療方法，通過高壓氧的環境實現治療的作用。有學者發現[6-7]，在高壓氧環境中，氧分子的間距增加，此時可以極大提高血氧張力，加速新生小血管和側支循環進行，維持人體生命活動。而且研究還證實[8-9]，HBO可加速組織內骨痂膠原蛋白生成速度及骨痂鈣鹽沉積。PⅠNP是骨形成初期的敏感指標之一，CTX-Ⅰ作為骨吸收狀態下Ⅰ型膠原釋放的主要因子，其表達高低決定Ⅰ型膠原含量多少，CTX-Ⅰ的表達能夠體現成骨細胞的活性和骨吸收的情況，是診斷骨質疏松癥的金指標[10-11]。CBF-α1是影響成骨細胞分化的重要因子，CBF-α1能夠促進成骨細胞進行表達，人體骨骼才能得以正常生長，維持骨骼正常發育。CBF-α1還能夠調控雙向調節成骨細胞的分裂分化過程，加速未分化成骨細胞的表達及已分化成骨細胞的活性[12]。通常情況下，成骨細胞會分泌OC，OC的表達高低能直接反映成骨細胞的活性和功能變化[13]。骨代謝的平衡情況都可以通過CTX-Ⅰ、NTX-1、CBF-α1以及OC表達來體現。BALP是由下丘腦分泌一種活性因子，通過介導破骨細胞，影響骨吸收，是骨吸收的標志物之一。有文獻表明[14-15]，BALP通過誘導成骨細胞的形成，加速骨吸收，從而使骨密度增加，提高骨強度，加速骨吸收的速度；同時，OP的發生與發展，也與骨密度和骨小梁微結構的變化密切相關。

本實驗證實，大鼠摘除卵巢后，其BMD顯著降低，骨小梁微結構損傷不完整，證明OP模型成功建立。與空白組相比，OP大鼠血清中骨代謝相關標記物BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PⅠNP、OC、E2含量顯著變化，BMD明顯降低，骨小梁顯微結構不完整，提示OP大鼠骨量減少，骨吸收能力增多，骨形成減少，符合臨床中OP的臨床表現。與模型組相比，經過高壓氧的干預治療，OP大鼠骨密度明顯增加，骨小梁微結構發生明顯改善，骨量流失減緩。這與權學蓮等[16]的研究結果相類似。但在本研究中，高壓氧治療延緩骨質疏松的作用機制尚不明確，有待在接下來的實驗中探究。

綜上所述，高壓氧可減輕大鼠骨量減少骨密度的降低，加速骨質疏松后骨質的礦化和骨的生成，并能改善骨微結構。這也提示，高壓氧治療可能成為絕經后骨質疏松癥患者的輔助治療方案，但具體機制仍有待研究。