circ_0000285靶向miR-625對缺氧/復氧誘導的心肌細胞氧化應激損傷的影響

莊媛 郝艷麗 黃鶯 李延輝 孫穎 李悅 盧云鳳 吳濤

缺血性心臟病是由冠狀動脈閉塞或狹窄引起的心血管疾病，是世界范圍內致殘和死亡的主要原因之一。血流恢復是緩解心肌缺血損傷的有效干預手段，然再灌注本身可導致額外的心肌損傷和病理性重構，即心肌缺血/再灌注(I/R)損傷[1]。因此，減弱I/R導致的心肌損害對改善缺血性心臟病患者預后意義重大。環狀RNA(circRNA)是由前體mRNA反向剪切形成的單鏈封閉環結構的RNA分子，通過與miRNA結合調節靶基因表達發揮功能，與心肌梗死、心臟衰老、心臟肥大、動脈粥樣硬化發生關系密切相關，是心血管疾病治療的理想靶點[2,3]。circRNA 0000285(circ_0000285)是一種致癌基因，研究發現糖尿病腎病小鼠和高糖誘導的腎足細胞中circ_0000285表達升高，干擾circ_0000285表達減弱高糖誘導的足細胞損傷[4]。生物信息學預測顯示，miR-625是circ_0000285的潛在靶點。miR-625對心肌肥厚具有抑制作用[5]。然而，circ_0000285是否靶向miR-625在心肌I/R損傷中發揮作用并不明確。本研究構建心肌細胞缺氧/復氧(H/R)模型模擬I/R損傷過程，探討circ_0000285對H/R誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激損傷的影響，分析其機制是否與調miR-625表達相關。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細胞H9C2購于中國典型培養物保藏中心；miRNA檢測試劑盒購于美國GeneCopoeia公司；逆轉錄試劑盒、SYBR-Green PCR試劑盒購于北京天根生化科技公司；針對circ_0000285的小干擾RNA(si-circ_0000285)及其陰性對照(si-NC)、miR-625模擬物及(mimics)其陰性對照(miR-NC)、miR-625抑制物(anti-miR-625)其陰性對照(anti-miR-NC)、雙熒光素酶報告載體由北京六合華大基因公司提供；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購于上海銳賽生物公司；丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測試劑盒北京索萊寶科技有限公司；兔源B細胞淋巴瘤-2蛋白(Bcl-2)、Bcl相關x蛋白(Bax)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體和羊抗源IgG二抗購于美國Abcam公司。微量分光光度計(型號NanoDrop 2000)購于美國Thermo Scientific公司；流式細胞儀(型號CytoFLEX)購于美國貝克曼公司；濕式轉膜儀(型號1703930)購于美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 H9C2細胞培養、H/R模型構建:用含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗DMEM培養液在37℃、5% CO2、95%空氣培養箱中培養H9C2細胞，當在顯微鏡下觀察到細胞60%匯合時，消化細胞，按照1∶4比例傳代培養。取對數期H9C2細胞接種缺氧培養基，置于缺氧培養箱(37℃、5% CO2、94% N2)培養3 h，磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次，更換為復氧培養基，放置常氧培養箱(37℃、5% CO2、95% 空氣)中繼續培養4 h，構建H9C2細胞H/R模型[6]。

1.2.2 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測circ_0000285和miR-625表達:TRIzol試劑提取對照組、H/R組H9C2細胞的總RNA，分光光度計檢測RNA質量。采用miRNA檢測試劑盒測定miR-625表達。采用逆轉錄試劑盒、SYBR-Green PCR試劑盒檢測circ_0000285表達。GAPDH和U6分別作為circ_0000285和miR-625的內參基因，2-ΔΔCt法計算其相對表達量。circ_0000285上游引物5’-TACCTCTGCAGGCAGGAACT-3’，下游引物5’-TCACATGAATTTAGGTGGGACTT-3’；GAPDH上游引物5’-GCCATCACAG CAACACAGAA-3’，下游引物5’-GC CATACCAGTAAGCTTGCC-3’；miR-625上游引物5’-GCGGCAGACTATAGAACTTT-3’，下游引物5’-CAGTGCGTGTCGTGGA-3’；U6上游引物5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下游引物5’-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.2.3 細胞轉染和實驗分組:將對數期H9C2隨機分為以下組別。對照(Con)組為正常培養的H9C2細胞；H/R組參照上述建模方法；H/R+si-NC組、H/R+si-circ_0000285組、H/R+miR-NC組、H/R+miR-625組、H/R+si-circ_0000285+anti-miR-NC組、H/R+si-circ_0000285+anti-miR-625組為采用脂質Lipofectamine 2000將si-NC、si-circ_0000285、miR-NC、miR-625 mimics、si-circ_0000285+ anti-miR-NC、si-circ_0000285+anti-miR-625分別轉染至H9C2細胞，轉染48 h后進行H/R處理。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡:用胰蛋白酶收集各組H9C2細胞，重懸于結合緩沖液中調整細胞密度為2×105個/ml。取500 μl細胞懸液加入EP管中，隨后加入5 μl的annexin V-FITC和5 μl的PI孵育10 min。混勻后，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 試劑盒檢測MDA含量、SOD和GSH-Px活性:收集各組H9C2細胞EP管，棄去上清液。按照試劑盒說明書加入提取液，超聲波破碎細胞，按照10 000 r/min在4℃離心機離心10 min，收集上清液于EP管置于冰上。參照試劑盒說明書測定MDA含量以及SOD和GSH-Px活性。

1.2.6 免疫印跡法檢測Bcl-2和Bax蛋白表達:使用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，采用二喹啉甲酸法測定每個蛋白樣品的濃度。將適量蛋白樣品與等體積的2×蛋白上樣緩沖液混合，沸水浴加熱5 min。取40 μg 蛋白樣品加至SDS-PAGE凝膠加樣孔，設定電壓100 V、時間110 min進行電泳。設定轉膜電流為300 mA、時間為60 min利用標準濕式轉膜裝置將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上。洗膜液漂洗膜2 min，加入5%脫脂牛奶在搖床上搖動封閉60 min。吸盡封閉液后，加入稀釋好的一抗4℃緩慢搖動過夜。洗膜液漂洗膜5 min，漂洗3次。稀釋好的二抗在側擺搖床上室溫孵育1 h。采用化學發光液進行顯色反應，Image J軟件分析目的條帶灰度值。蛋白相對表達量=灰度值目的條帶/灰度值GAPDH。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗:合成Circ_0000285野生型(WT)序列(包含miR-625結合位點)或Circ_0000285突變型(MUT)序列(含有突變位點)，將上述序列分別插入pmirGLO載體，構建熒光素酶報告載體WT-circ_0000285、MUT-circ_0000285。分別用Lipofectamine 2000試劑將這些載體與miR-625 mimic或miR-NC共轉染至H9C2細胞。轉染48 h后，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統測定相對熒光素酶活性。將pcDNA、pcDNA-circ_0000285、si-NC、si-circ_0000285分別轉染H9C2細胞，按照1.2.1步驟檢測轉染48 h后細胞中miR-625表達量。

2 結果

2.1 circ_0000285和miR-625在缺氧復氧誘導的H9C2細胞損傷中的表達 H/R組H9C2細胞中circ_0000285表達量與Con組比較顯著升高(P<0.05)，而miR-625表達量與Con組比較顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 circ_0000285和miR-625在缺氧復氧誘導的H9C2細胞損傷中的表達

2.2 抑制circ_0000285表達對缺氧復氧誘導的H9C2細胞氧化損傷的影響 與Con組比較，H/R組H9C2細胞circ_0000285表達量顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達量、MDA含量顯著升高(P<0.05)，而SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；與H/R+si-NC組比較，H/R+si-circ_0000285組H9C2細胞circ_0000285表達量顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達量、MDA含量顯著降低(P<0.05)，而SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 抑制circ_0000285表達對缺氧復氧誘導的H9C2細胞凋亡的影響；A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表2 抑制circ_0000285表達對缺氧復氧誘導的H9C2細胞氧化損傷的影響

2.3 circ_0000285靶向調控miR-625的表達 miR-625與circ_0000285序列間存在特異性互補結合位點。與轉染miR-NC比較，轉染miR-625 mimics顯著降低H9C2細胞WT-circ_0000285的性對熒光素酶活性(P<0.05)，而對MUT-circ_0000285的相對熒光素酶活性物顯著影響。pcDNA-circ_0000285組H9C2細胞中miR-625表達量與pcDNA組比較顯著降低(P<0.05)；而si-circ_0000285組H9C2細胞中miR-625表達量與si-NC組比較顯著增加(P<0.05)。見圖2，表3、4。

表3 雙熒光素酶報告實驗

圖2 circ_0000285的序列中含有與miR-625互補的核苷酸序列

2.4 miR-625過表達對缺氧復氧誘導的H9C2細胞氧化損傷的影響 與H/R+miR-NC組比較，H/R+miR-

表4 circ_0000285調控miR-625的表達

625組H9C2細胞miR-625表達量顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達量、MDA含量顯著降低(P<0.05)，而SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。見表5，圖3。

表5 miR-625過表達對缺氧復氧誘導的H9C2細胞氧化損傷的影響

圖3 miR-625過表達對缺氧復氧誘導的H9C2細胞凋亡的影響；A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

2.5 抑制miR-625表達逆轉抑制circ_0000285表達對缺氧復氧誘導的H9C2細胞氧化損傷的作用 與H/R+si-circ_0000285+anti-miR-NC組比較，H/R+si-circ_0000285+anti-miR-625組H9C2細胞miR-625表達量顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達量、MDA含量顯著升高(P<0.05)，而SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。見圖4，表6。

表6 抑制miR-625表達逆轉了抑制circ_0000285表達對缺氧復氧誘導的H9C2細胞氧化損傷的作用

圖4 抑制miR-625表達逆轉了抑制circ_0000285表達對缺氧復氧誘導的H9C2細胞凋亡的作用；A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

3 討論

心肌I/R損傷涉及廣泛的生物學過程，包括細胞凋亡和氧化應激損傷。缺血和再灌注階段可產生活性氧，過量活性氧可直接損傷蛋白質、脂質和DNA分子等細胞成分，誘導細胞凋亡級聯反應，最終導致心肌損傷[7]。本研究顯示H/R處理后，細胞凋亡率、脂質過氧化終產物MDA含量顯著增加，而抗氧化酶SOD和GSH-Px活性顯著降低，提示H9C2細胞H/R損傷模型構建成功。目前關于circ_0000285相關研究主要集中在腫瘤方面，干擾其表達可抑制肝癌[8]、骨肉瘤[9]、喉癌[10]等惡性腫瘤細胞增殖和轉移。本研究發現H/R處理的H9C2細胞中circ_0000285表達量顯著增加，提示circ_0000285表達改變可能與H9C2細胞H/R損傷有關。驗證circ_0000285功能顯示，干擾其表達顯著降低MDA含量、凋亡率，提高SOD和GSH-Px活性，說明干擾circ_0000285表達通過提高H9C2細胞抗氧化能力來減輕氧化應激以抵抗H/R損傷。Bcl-2基因家族是最重要的凋亡調節因子，Bcl-2是一種凋亡抑制蛋白，其過表達可以阻斷各種刺激誘導的凋亡，而Bax在凋亡刺激下移位至線粒體膜誘導細胞色素c釋放發揮促凋亡作用[11]。本研究中干擾circ_0000285表達顯著上調Bcl-2蛋白表達、上調Bax蛋白表達，與其對H/R處理的H9C2細胞的抗凋亡作用吻合。以上研究表明，干擾circ_0000285可拮抗H/R誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激損傷。

對circ_0000285相關研究進行分析表明，其生物學作用的發揮多與調節miRNA表達有關[12]。如干擾circ_0000285通過負調控miR-197-3p表達誘導宮頸癌細胞G0/G1期阻滯、自噬和凋，抑制宮頸癌進展[13]。本研究通過雙熒光素酶實驗證實miR-625是circ_0000285的靶基因，并進一步證實過表達或干擾circ_0000285可下調或上調miR-625表達水平。miR-625已被證實具有神經保護功能，敲減長鏈非編碼RNA p21(lncRNA-p21)表達通過上調miR-625表達可增加SOD活性，減輕1甲基4苯基吡啶離子(MPP+)誘導的神經元毒性、細胞凋亡、氧化應激和神經炎癥[14]。miR-625還可改善脂多糖誘導的支氣管上皮細胞炎性反應[15]。本研究發現H/R處理的H9C2細胞中miR-625表達量顯著降低，過表達miR-625顯著提高H9C2細胞抗氧化能力、降低氧化應激損傷和細胞凋亡，保護H9C2細胞免受H/R損傷。進一步研究發現，抑制miR-625表達顯著減弱干擾circ_0000285表達對H/R處理的H9C2細胞凋亡、氧化應激損傷的影響，這間接證實circ_0000285對H9C2細胞H/R損傷的調控功能是通過靶向負調控miR-625表達實現的。

綜上所述，H/R刺激可誘導circ_0000285在H9C2心肌細胞中表達，抑制miR-625表達。干擾circ_0000285表達通過上調miR-625可減弱H/R誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激損傷。因此，circ_0000285/miR-625途徑在開發缺血性心臟病藥物干預可行靶點方面可能具有潛在臨床應用價值。