基因編輯技術在我國畜牧業的研究進展

張格陽 張子敬 翟亞瑩 呂世杰 朱肖亭 朱進華 李崢 于翔 王紅利 施巧婷 閆祥洲 王二耀*

（1.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養調控重點實驗室，河南鄭州 450002；3.河南農業大學動物科技學院，河南鄭州 450008；4.河南省動物檢疫總站，河南鄭州 450000；5.河南省郟縣紅牛產業發展中心，河南平頂山 467100）

基因編輯（geneediting）簡單講是通過對基因進行定點修飾、定位敲除以及插入目的基因片段來改變其特征和功能的技術。目前，鋅指核酸內切酶（zincfingerendonuclease，ZFN）、類轉錄激活因子效應物（transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TAL ENs）和新型基因編輯技術CRISPR/Cas9 系統是3 種主要基因編輯技術。近年來，基因編輯技術取得了喜人的進展，被越來越多的人熟知和關注。除了廣泛應用于人類生命科學研和及臨床應用外，在畜牧業也有應用。

畜牧業作為支撐我國農業經濟的支柱之一，不僅是實現經濟繁榮的重要內容，也是發展生態農業的關鍵途徑。高效精準的基因編輯技術為研究家畜的疾病機制和培育良好品質品種家畜提供了強有力的“武器”。在治療家畜疾病方面,通過特定基因編輯技術在DNA 水平上使用能良好表達的基因來替換或補償致病基因突變，抑或是切除致病性基因,從而達到治療疾病的目的。在家畜遺傳育種方面，與傳統育種方式不同，在有一定安全性保障的同時，根據人們的不同需求，借助基因編輯技術在指定位置對基因實施定點編輯。一方面極大縮短了育種時間，另一方面也降低了育種過程中的人力、物力、財力成本[1]。

1 主要基因編輯技術

1.1 鋅指核酸酶（ZFN）技術

鋅指核酸酶（ZFN）：由DNA 識別域鋅指蛋白（Zinc-Finger Protein，ZFP）（負責識別）與DNA 切割域限制性核酸內切酶FokI（負責切割）構成。

機理：ZFN 作為人工合成的限制性內切酶通過其鋅指DNA 結合域、DNA 切割域發揮作用。研究者通過改造DNA 結合域，靶向定位于不同的DNA 序列，再由DNA 切割域進行特異性切割。此外，ZFN 技術還可與細胞內DNA 修復機制共同發揮作用，使研究者自由編輯基因組。

鋅指核酸酶（ZFNs）在基因靶向修飾方面起到促進作用，盡管如此，為了彌補鋅指基序與其靶序列間缺乏特異性缺陷，構建大型文庫用來篩選能與靶點序列特異性結合的鋅指蛋白是必不可少的步驟。與此同時，該技術的弊端還有易脫靶、細胞死亡、額外突變等[2]。

1.2 類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）技術

類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）：TALEN 為第二代基因組編輯核酸酶。TAL 效應因子（TALE）可以特異性結合目的序列，通過將一段人造TALE 與FokI 核酸酶連接起來，即組成了TALEN，一類具有特異性基因組編輯功能的強大工具。

與ZFNs 技術相比，因為TALEN 具有高度特異性，能與DNA 靶位點結合，大大降低了功能蛋白脫靶的幾率。并且與ZFNs 相比，TALEN 具有靈活性強、操作簡便、構建更便捷、脫靶效應和細胞毒性低等優勢。但裝配TALEN 模塊是一個高強度、費時、費力的過程。

1.3 CRISPR/Cas9 系統

CRISPR 序列由眾多短而保守的重復序列（repeats）和間隔區（spacer）組成。間隔區是一些可變序列，其與先前入侵細菌基因組外的外源遺傳物質的序列相對應。這些間隔序列儲存在細菌基因組內，被看作是通過再感染來觸發降解入侵病毒DNA 的記憶機制。

機理：①具有核酸酶活性的Cas9 蛋白質在sgRNA 引導下特異性地識別原間隔序列的相鄰序列。②Cas9 蛋白質到達目標DNA 的指定部位后，發揮核酸酶作用，切斷DNA 雙鏈，引起雙鏈斷裂（double-strandbreak，DSB）。③雙鏈dna 盾斷裂后啟動細胞自我復原系統，利用非同源末端的連接復原（non-homologous end-joining，NHEJ）和同源重組修復（homology dependent repair，HDR）兩種方式的基因修復。研究人員可以導入外源基因，通過同源重組將目標基因重組為目標基因，并通過在接收細胞中表達外源基因來進行基因編輯。

CRISPR-Cas9 技術優勢在于構建和使用時非常簡單、方便和低成本，使用它可以用來同時瞄準多個基因的優勢，可以逐條甚至批量檢測人類或動物基因組中的基因表達和互做情況,以明確基因的功能及調控網絡。但易脫靶一直是CRISPR-Cas9 技術亟待解決的問題。

2 基因編輯技術在畜牧業上的應用

基因編輯技術為畜牧業發展做出了極大貢獻。在改良生產性能方面，基因編輯技術通過改造動物基因組，大力改良畜禽經濟性狀，加快生長速度，提高飼料利用率等。在改善肉質方面，為達到人們對肉質的需求，基因編輯方法既可以降低動物脂肪量，也可以降低其肌肉質量；在提高家畜抗病力方面，開發具有抗藥性的新物種，增加動物基因適應性，減少抗生素使用，促進人類健康和環境保護的研究；在構建疾病模型方面，轉基因動物的應用既能開發人類疾病模型，也有助于理解疾病的運作機理和治療方法。

2.1 豬

全世界第一例POSA26 定點基因敲入豬模型來源于2014 年Li 等采用了TALEN 介導的基因敲入技術獲得的結果[3]。賴良學等開發了ZFN 和TALEN 靶向技術，并將其應用于豬基因組修飾中[4]。該研究小組通過ZFN 獲得了PPARγ 基因敲除豬。研究小組又使用TALEN 技術將一對外來loxp 引入豬基因組的ROSA26 位點，可以將任意的基因通過重組酶介導插入到ROSA26 的位點處，并且在豬組織中實現目標基因的無差異表達。Yang 等用ZFN 技術分別得到敲除GGTA1（α 1,3-galactosyltransferase）基因和PPARγ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma）基因的克隆豬，并且在原代細胞中觀察到雙等位基因失活的比率達到1%，這比之前同源重組的打靶效率高10000 倍[5]。中國科學院動物研究所周琪等研究團隊構建了CRISPR/Cas9 系統，利用“一步法” 直接將切割v WF 基因的CRISPR-Cas9 系統注射到豬受精卵中，該方法非常便利、安全和高效[6]。研究發現，敲除豬以及相應的宿主細胞中CD163 全蛋白或者是病毒互相作用的SRCR5 區基因，可以使其對I 型和II 型的PRRSV 分離株產生抵抗力。2018 年，華南農業大學吳珍芳帶領的團隊將CRISPR/Cas9 基因編輯技術與體細胞核移植（Somatic Cell nuclear transfer，SCNT）相結合，獲得了一頭敲除CD163 基因的杜洛克豬[7]。2018 年，研究人員利用CRISPR/Cas9 將靶向非洲豬瘟（ASFV）磷蛋白p30（ASFV-p30）導入病毒體內，結果發現，由ASFV 引起的空斑完全消失，且毒力下降4 個數量級。2014 年，Hai 等通過卵顯微注射和CRISPR/Cas9 系統組合的辦法成功獲得血管性血友病因子（vWF）雙等位基因敲除的小型豬[8]。Yu 等利用CRISPR/Cas9 技術獲得了可用于研究杜興氏肌肉營養不良癥（Duchenne Muscular Dystrophy，DMD）基因敲除肌營養不良癥疾病模型[9]。Zhou 等采用顯微注射技術，分別將豬酪氨酸酶基因、PARK12 基因以及PINK1 基因的gRNA 和Cas9 調至豬成纖維細胞中，順利獲得敲除這些基因后的純合子細胞[10]。并且把經人工篩選出來的敲除酪氨酸酶基因純合子當做供體，經由體細胞核移植后得到因敲除酪氨酸酶基因本應為黑色的表現為白的版納豬。研究人員利用CRISPR/Cas9 技術也在豬成纖維細胞中成功進行了肌肉生長抑制素基因敲除，為建立基因敲除的克隆豬和新豬種培育打下了基礎。2015 年，Cui 等利用ZFNs 技術成功敲除了豬的生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）基因，該試驗為進一步研究人類侏儒綜合征提供了理想的動物模型[11]。

2.2 牛、羊

張存芳研究表明，利用ZFN 技術將雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）引入羊肌肉生長抑制素（MSTN）基因，誘導細胞自身固有的非同源末端（non-homologous end-joining，NHEJ）修復途徑提高MSTN 基因敲除效率，為通過胚胎工程手段獲得產肉性能高的轉基因家畜奠定基礎[12]。利用ZFN 在牛中高效產生MSTN 雙等位基因突變[13]。

MSTN 屬于TGF-β 超家族，抑制肌肉細胞生長。Luo 等利用組裝后的ZFN 來破壞編碼肌肉生長抑制蛋白的牛MSTN 基因，同時又采用ZFN 技術誘導基因靶向策略，突變頻率約為20%，雙等位基因突變效率為8%，通過SCNT 成功獲得了來自黃牛的MSTN 基因靶向成纖維細胞克隆牛[13]。在牛、山羊和豬的細胞基因中導入特異的自然突變體和單核苷酸多態性（SNP），是Tan 等在2013 年利用TALEN 技術和同源重組做的研究，如把Celtic 牛的無角基因POLLED 導入有角的奶牛，將豬、羊的Pc、GDF8、p65 和LDLR基因引入SNP 等[14]。

選定以山羊成纖維細胞進行試驗后，Ni 等以山羊MSTN 基因、核孔蛋白（NUP）基因、病毒蛋白（PrP）基因以及β-乳球蛋白（BLG）基因為對象設計了gRNAs，并且依據CRISPR/Cas9 技術同時編輯了4個基因，敲除細胞雙等位基因MSTN 后，又經過體細胞核移植手段成功獲得基因敲除后的山羊后代[15]。中國農業大學呼銳利用CRISPR/Cas9 技術將Cas9 mRNA 和sgRNA（Single Guide RNA）注射到原核，成功生產出FGF5 基因敲除羊[16]。

3 基因編輯技術的發展與應用前景

基因編輯技術解決了家畜育種周期長和遺傳資源少等問題，大大縮短了育種周期，降低育種成本，迅速增加了遺傳多樣性。有了基因編輯技術的加持，畜禽基因功能的研究和轉基因育種變得更加高效。基因編輯技術彌補了傳統轉基因技術的整合隨機、遺傳不穩定等缺陷。基因編輯技術前景廣闊，特別是CRISPR/Cas9 技術因為其簡單、高效、成本低等原因，越來越多地被研究人員認可、使用。采用基因編輯技術，我們也可以進行以下研究和應用：①基因遺傳功能和控制方面的基本生物研究；②為提高畜禽生產能力或者質量而進行的轉基因育種；③轉基因生物反應器；④抗病育種；⑤人類疾病的轉基因模型；⑥作為異質器官移植的供體。

基因編輯技術正在迅速發展，其缺陷也正在被研究和攻克。總有一天，基因編輯將極大促進轉基因技術在畜牧領域的應用。