幾種炎癥模型的小鼠造模方法研究進展

劉雨然,連科迅 ,谷新利

(石河子大學動物科技學院,新疆 石河子 832003)

炎癥是多種生理反應及病理狀態的基礎,實質上是活的機體對于外界環境中不利因素的一種防御反應,是機體與外界刺激的損傷與抗損傷的病理過程,其目的是使機體內環境處于一種相對平衡的生理狀態。

炎癥在有利干預下一般是可控的,且對機體而言是有利的反應,但由于在生產生活中對炎癥發現不及時或是治療方法有誤會導致炎癥病情惡化,通常會由急性炎癥轉變為慢性炎癥。在慢性炎癥持續過程中,一些細胞因子持續分泌(例如TNF-α、IL-11、IL-12 等)會加重對機體的損傷,嚴重時對機體產生惡劣且不易逆轉的影響,對畜牧業而言則會導致嚴重的經濟損失[1]。因此,為了能更全面的了解不同炎癥的特點,更快速有效的研發治療藥物從而減少經濟損失,開展動物實驗是行之有效的解決方案。

小鼠與人有95%的基因具有同源性,與其他經濟動物基因也有高度的同源性且其生理結構也大致相同(例如小鼠乳腺與奶牛乳腺生理結構幾乎相同),并且由于小鼠具有價格低廉,繁殖性能強等優勢,因而無特定要求下通常以小鼠作為實驗動物。在此,本文將主要介紹肺炎模型、結腸炎模型以及乳房炎模型的小鼠造模方法以及相關研究進展。

1 肺炎模型

肺是陸生動物進行氣體交換的主要器官及場所。由于肺是機體與外界直接接觸器官,從而為病原體入侵與定植提供了條件,雖然肺部的非特異性免疫系統可以消滅絕大多數的病原體,但也有一部分會逃脫免疫系統從而誘發肺炎等一系列疾病。肺炎是嚴重的、有時危及生命的主要疾病之一,其發生嚴重影響了人類健康以及畜牧業的發展。肺炎的生理病理學已被廣泛研究,為這種疾病的新治療方法的開發提供了信息。除了體外研究,動物模型已廣泛應用于肺炎領域。

1.1 肺炎模型動物選擇

在肺炎模型中,因哺乳動物在肺部的解剖結構以及生理功能大致相同,所以通常作為受試對象。在評估整體的生理心血管監測和血流動力學時,由于要進行肺的力學性測量,肺炎模型首選大型哺乳動物,如兔子、狗、豬、狒狒等[2],雖然已經在狒狒身上得到了成功的驗證,但仔豬是目前使用最頻繁的模型。相比之下,多菌感染主要在嚙齒動物中進行評估,特別是小鼠和大鼠。嚙齒動物體型小,繁殖率快,有利于實驗室研究的許多實用性。近親交配的小鼠品系(如BALB/c 小鼠、C57BL/6J 小鼠等)通常用于排除基因的干擾,這些動物有助于使用遺傳方法來了解疾病的分子機制。目前基因工程在小鼠胚胎干細胞的應用已有成功案例,并且已經產生了各種各樣的攜帶功能喪失、功能獲得的轉基因小鼠[3]。本節就小鼠的肺炎模型構建方法進行綜述。

1.2 肺炎模型造模方法

目前,已成功構建出一些可以很好模擬肺炎的動物模型,其中包括直接接觸法、氣霧接種法、氣管注射法及經口插管法以及鼻腔滴入法,每種模型都有其優點以及缺點(見表1),因此需要根據實驗具體實際情況進行妥善選擇。在此對小鼠肺炎模型的各種造模方法進行綜述。

表1 肺炎模型構建方法及其優缺點Table 1 Pneumonia model construction method and its advantages and disadvantages

1.2.1 直接接觸法

一些呼吸道病原體可以通過液滴核或身體接觸傳播,方法是將未感染的動物與已感染動物放在相對密閉的環境中。這種方法具有模仿傳染性感染的自然傳播的吸引力,并且病原體通可過小鼠可以提高毒力[4]。小鼠微弱的咳嗽反射可能限制了呼吸道病原體的群居傳播,這可能對自然的小鼠病原體最有用。這種實驗設計的缺點包括無法控制接種量、感染時間或感染動物的數量。

1.2.2 氣霧劑接種法

許多下呼吸道感染是通過吸入傳染性氣霧劑而獲得的,包括結核病、軍團菌病、支原體和衣原體感染、真菌肺炎和呼吸道病毒感染?？赏ㄟ^將小鼠暴露于全身或僅鼻腔中的霧化微生物來模仿空氣傳播模式。在全身暴露系統中,將實驗動物置于有窗或網狀隔間的封閉房間內,由一個或多個噴霧器產生的可呼吸氣霧劑被負壓吸引進入到鼠籠中。調節總風量以滿足動物的通風需求,并可通過控制濕度以優化微生物的生存能力。暴露的時間通常為30～60 min。此外還可以將小鼠置于只暴露鼻子的特定裝置或底部開口的50 mL 離心管中,以便只有它們的鼻子暴露在氣霧室中,暴露時間通常較短(5～15 min)[5]。通過此方法接種的微生物可在小鼠肺中均勻分布。

1.2.3 氣管注射法及經口插管法

這兩種方法都需要全身麻醉。氣管注射法是通過手術暴露已麻醉小鼠的氣管,然后用針頭為25～30 G 規格的注射器,將微生物懸浮液按5～50 μL 的體積注入氣管內,然后對傷口進行縫合[6]。經口插管法是通過口-氣管途徑獲得感染,第一步是將小鼠上門牙懸吊,使其處于垂直懸掛狀態,然后用一個牽引器將舌頭向前移位,在動物處于麻醉且穩定狀態時,用1 mm 金屬鈍針管與大小相似的塑料軟管鏈接插入到小鼠氣管內,將微生物懸浮液按5～50 μL 的體積注入氣管內。接種后的小鼠保持垂直姿勢(細菌在重力作用下向肺泡的遠端遷移),直到麻醉消失。這項技術已被證明可將99%以上的接種物輸送到肺部,但由于操作人員的手法及技術不同,有可能導致接種的微生物在小鼠左右兩肺的分布沉積不均勻[7]。

1.2.4 鼻腔滴入法

鼻腔滴入法是目前來說較為普及的一種小鼠肺炎模型構造方法,此方式可以很好的模擬上呼吸道以及下呼吸道的感染。在此方法中,使麻醉的小鼠保持垂直位置,將微生物懸浮液沉積在鼻孔中,滴入后靜止1 min 左右,以確保接種病原體被吸入到呼吸道中。接種量從5～50 μL 不等,但較小的接種量往往局限于上呼吸道。

2 炎癥性腸炎模型

腸道是機體最大的免疫器官,能對進入腸道的病原體進行有效的免疫應答,是機體抵抗外來入侵物的第一道防線,而且還是機體進行全身性免疫功能調節的場所。腸道是與外界相通的器官,每天都會有不同的病原體、微生物入侵腸道,當機體發生應激、創傷或者機體抵抗力下降時,這些外來分子進入腸道,破壞腸粘膜屏障,使腸絨毛變短或者消失,腸上皮細胞壞,導致炎性細胞大量聚集,釋放出大量的促炎因子如IL-6、IL-Iβ 和TNF-α 等,這些炎性因子能使巨噬細胞發生趨化作用,進一步合成環氧化酶,導致動物腸道炎癥的發生,進而導致腹痛、腹瀉、便血的發生。

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是發生于腸道的慢性炎癥性腸病,根據其發生部位以及病理學特點的不同,分為克羅恩病(Crohn’s disease,CD)以及潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC),兩者均出現腹瀉、血便、體重減輕、精神不振、食欲減退、發熱等癥狀。UC 在腸鏡下可以發現其病變部位的潰瘍主要發生在結腸粘膜,其組織學病變通常表現為粘膜潰瘍,固有層炎性浸潤和肉芽腫發展;而CD 在病變處的粘膜觀察不到明顯的炎性癥狀,組織學觀察科發現病變處有非干酪樣肉芽腫性炎癥[8]。因此在臨床上IBD 主要診斷方法采用腸鏡以及活檢相結合的方式來進行區分。

雖然有很多文獻已經記錄了IBD 的發病機制,但仍然存在一些分歧。研究發現,結腸上皮細胞、粘膜屏障和上皮屏障缺陷與潰瘍性結腸炎的發病機制密切相關[9]。由于對IBD 誘發原因不甚了解,對預防疾病發生的工作造成了很大的困難,所以目前針對IBD 的方法主要為藥物以及手術治療法[10]。為了開發出針對IBD 的新型藥物避免手術對身體造成的危害,動物模型成為此方法的關鍵,由于小鼠與人以及畜牧業經濟動物的腸道結構及發病癥狀幾乎相同,所以用小鼠構建IBD 模型成為大眾潮流。目前研究IBD 的小鼠模型主要有基因工程類IBD 模型、化學誘導類IBD 模型、細菌誘導類IBD 模型以及自發類IBD 模型[11]。由于化學誘導的腸道炎癥模型炎癥的發生是即刻的且操作相對簡單,所以常用化學誘導來模擬IBD 疾病。

2.1 三硝基苯磺酸(TNBS)誘導腸炎造模方法

通過灌腸方法將溶解在乙醇中的TNBS 注入小鼠直腸內,可以誘導結腸炎。乙醇作用是破壞腸道粘膜屏障,而TNBS 作為半抗原與小鼠體內蛋白結合,使之宿主免疫系統產生免疫原性。由于CD4+T細胞已被證明在慢性TNBS 結腸炎中起中心作用,該模型有助于研究T 輔助細胞依賴的粘膜免疫反應[12]。

先將丙酮和橄欖油以4 ∶1 的體積比充分混合,隨后將4 體積的丙酮/橄欖油與1 體積的5% TNBS溶液充分混合后得到1%(w/v)的TNBS 預敏液。在背部或肩部預剃毛的小皮膚處均勻涂抹150 μL TNBS 預敏液進行預致敏。在第8 天,用肛門導管將100 μL 與無水乙醇1 ∶1 混合的5% TNBS 溶液注入已麻醉小鼠肛門內4 cm 左右處,緩慢拔出肛門導管,保持小鼠頭部朝下姿勢約60 s[13]。TNBS 是一種危險化合物,易燃易爆且有致癌作用,因此在實驗操作過程中要嚴格遵守實驗室安全規定以及個人防護。

2.2 惡唑酮(Oxazolone)誘導結腸炎造模方法

直腸注射溶解于乙醇惡唑酮半抗原試劑可引起小鼠的嚴重結腸炎,癥狀為體重減輕、腹瀉和杯狀細胞明顯丟失,在SJL/J 小鼠中,炎癥只影響遠端結腸,特別是粘膜層[14]。未受刺激和αCD3/αCD28刺激的固有層T 細胞的組織學特征和Th2 細胞因子(IL-4、IL-5 和IL-13)的產生在某些方面與人類UC 相似。與其他幾種小鼠結腸炎模型相比,中和抗IL-4 抗體或誘騙IL-13Rα2-Fc 蛋白治療可以改善疾病[15]。因此,該模型常被用來研究Th2 依賴的免疫反應在腸道炎癥中的作用。

將丙酮和橄欖油以4 ∶1 的體積比充分混合,將60 mg 惡唑酮鹽溶于2 mL 丙酮/橄欖油中,充分混合后得到3%(w/v)的惡唑酮預敏液。在背部或肩部預剃毛的小皮膚處均勻涂抹150 μL TNBS 預敏液進行預致敏。第8 天,用肛門導管將100 μL 將溶于50%乙醇中的1%(w/v)惡唑酮鹽溶液注入已麻醉小鼠肛門內4 cm 左右處,緩慢拔出肛門導管,保持小鼠頭部朝下姿勢約60 s。惡唑酮是一種危險化合物,易燃易爆且有致癌作用,因此在實驗操作過程中同樣要嚴格遵守實驗室安全規定以及個人防護。

2.3 葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導結腸炎造模方法

在飲用水中給小鼠喂食DSS 聚合物幾天會導致以血性腹瀉、潰瘍和粒細胞滲入為特征的高度重復性急性結腸炎。研究認為,DSS 對腸道上皮的隱窩細胞有直接毒性從而影響腸道粘膜屏障的完整性[16]。由于此模型在缺乏B 細胞和T 細胞的C.B17 SCID 以及RAG1-/-小鼠中同樣可以引發嚴重的IBD,適應性免疫系統在此模型中起的作用微乎其微[17]。因此,急性DSS 結腸炎模型對于研究先天性免疫機制在結腸炎發病中的作用尤為有用。此外,DSS 模型已被證明適用于對結腸上皮修復機制的研究。

2.3.1 急性UC 造模方法

選取分子量(MW)為36000～50000 的DSS 試劑,與無菌水配制呈2%～5%的溶液,按每只小鼠每天5 mL 的飲水量自由飲用DSS 溶液,連續7 d,期間每天都要更換新的DSS 溶液,第8 天更換為正常飲用水[18-19]。在造模過程中,有些小鼠采食量并沒有太大變化,但是仍會出現便血消瘦癥狀,因此不宜通過采食量來估計造模成功與否。由于實驗條件不同,所以造模濃度不是固定的,濃度過大小鼠會極度消瘦且一般會在4 d 后陸續死亡,可能會對實驗產生消極影響,通過在合理范圍內調整濃度,找到適宜濃度,以此來減少損失保證試驗的順利進行。

2.3.2 慢性UC 造模方法

藥物配制同急性UC 造模方法,當飲用DSS 溶液連續7 d 后(期間每天都要更換新的DSS 溶液),于第8 天更換為正常飲用水,連續14 d。在第22 天重新將小鼠飲水更換為相同濃度的DSS 溶液至第28 天;第29 天時用正常飲水替代DSS 溶液同樣連續14 d。在連續造模50 d 后更換為正常飲水[19]。造模濃度同樣需要根據實際情況合理調整。

3 乳房炎模型

奶牛乳房炎是指在奶牛乳腺中發生炎癥的一種傳染性疾病,可導致圍產期奶牛產奶量降低、產奶質量下降,且慢性乳房炎可導致奶牛產奶量不可逆轉的降低。雖然有研究表明噬菌體可以作為治療奶牛乳房炎的新型治療方法,但目前主要的治療方法是抗生素療法,而細菌耐藥性的產生和休藥期的必要性并不能有效的緩解全球奶牛乳房炎的發病率,對全球乳業產生的巨大的經濟影響[20]。

為了更好的了解奶牛乳房炎的發病機制以及尋找更好的治療藥物,體內實驗模型提供了有效的方法。雖然使用奶牛作為實驗動物可以更好地還原疾病,但是由于奶牛價格昂貴,體積較大,操作困難等原因一般不用奶牛進行造模。嚙齒動物如小鼠,具有5 對乳腺,胸部3 對,腹部2 對,每對乳腺相對獨立,一個乳頭開口對應一條乳導管這與奶牛的乳腺結構相似,且在小鼠乳腺中的細菌計數、中性粒細胞和組織學上的變化與奶牛相似[21]。早在1970 年Chandler[21]通過實驗成功建立了細菌性乳腺炎模型,隨后該模型被廣泛的運用于乳房炎的研究。隨著研究的不斷深入,構建了更多的乳腺炎模型例如漿細胞性乳腺炎模型、EchAMP 轉基因小鼠乳腺炎模型等[22]。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌是主要的乳房炎病原菌,已被證明分別用于奶牛亞臨床性乳房炎和臨床性乳房炎的體內研究模型[23-24]。

3.1 小鼠乳房炎模型病原體選擇

奶牛乳房炎主要由細菌引起,但真菌、病毒或孢子也可引起乳房內感染。但小鼠乳房炎模型通常還是用細菌作為病原體來進誘導,此外,有研究表明真菌也可以用來誘導小鼠乳房炎,然而在真菌研究中,小鼠乳房炎模型是研究念珠菌病的合適工具[25]。在臨床上,大多數奶牛乳房炎的是由細菌引起的,因此細菌性奶牛乳房炎的研究尤為重要。引起奶牛乳房炎的細菌主要分為3 類。第一類為傳染性細菌,最具代表性的是金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),在所有反芻動物的乳房內感染中,這種病原體的比例最大[26]。由于金葡菌的耐藥性以及小菌落變異株(small colony variants,SCV)的產生,使得亞臨床性奶牛乳房炎往往發展成為慢性奶牛乳房炎,給治療帶來了極大的困難。研究表明,金黃色葡萄球菌引起的小鼠乳房炎主要是急性型,動物通常在感染后幾天內死亡,為了模擬在奶牛身上觀察到的慢性感染,可以在小鼠接種細菌之前注射內毒素或脂多糖[26]。另一種奶牛乳房炎傳染性細菌為無乳鏈球菌(Streptococcusagalacae),與金葡菌相比,無乳鏈球菌對抗生素非常敏感,在臨床上可以很好地控制,因此只有少數研究使用無乳鏈球菌構建乳房炎模型[27]。引起奶牛乳房感染的第二種是環境細菌,與傳染性細菌不同的是,這些細菌長期在奶牛體內存活和繁殖但并不會引起炎癥的發生與機體處于互利共生的狀態。在動物免疫力低下或免疫功能異常時會打破這種動態平衡,此時就可能發生環境病原體的感染,這些細菌主要引起奶牛的臨床性乳房炎,而不是亞臨床感染。大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)是一種廣為人知的革蘭氏陰性桿菌,可引起結腸性乳腺炎。有研究表明,通過在小鼠乳腺接種大腸桿菌可以用來構建乳房炎模型,其特征非常類似于奶牛臨床性乳房炎的特征[21]。第三類可歸結為次要病原體,主要包括牛棒狀桿菌(Corynebacteriumbovis),凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase-negativeStaphylococci,CoNS)等。與前兩種致病菌相比,這一類細菌的致病性是微弱的,不會產生嚴重的感染癥狀,因此通常不用這類細菌來構建乳房炎模型[28-29]。

3.2 小鼠乳腺內接種技術

一般都使用乳腺注射技術來實現誘導小鼠乳腺炎的目的,所有的接種方法都需要在小鼠麻醉后進行。第一種方法是將高濃度菌液滴在小鼠的乳頭尖端,病原體沉積在乳頭尖端后通過乳頭開口,順著乳導管進入到乳腺,從而誘導乳房炎[30]。由于病原體進入小鼠乳腺的機會不同,所以此方法的發病率較低。第二種方法是在體式顯微鏡下找到乳頭管開口,隨后用針頭直徑小于75 μm 的注射器將病原體注射到小鼠乳腺內即可誘發小鼠乳房炎[31]。需要注意的是,哺乳期小鼠的乳口開口通常很容易觀察到,而非哺乳期的小鼠其乳頭覆蓋有一層死皮,因此在操作前應該去除。此外,還可以先將小鼠乳頭尖端剪去,用針頭不大于30 G 的注射器,通過乳導管插入幾毫米(不宜過深以防穿過乳腺注射乳腹腔)將病原體輸送到小鼠乳腺內。對于后兩種技術,可以使用低至10 個集落形成單位(CFU)來誘導乳房炎,而發病率很容易達到100%[32]。盡管如此,接種數量的減少反而會導致更廣泛的免疫反應,因此,需要接種更高數量的細菌,最高可達108CFU[33]。當然為了更好的反映乳房炎的病理狀況,造模用的小鼠最好選用哺乳期10～14 d 的雌鼠。

4 結語與展望

炎癥一直以來都困擾著我們的生活,對畜牧業的生產也造成了巨大的危害。當然近年來通過科技工作者的不斷努力創新在抗炎藥物的研究上也已有了突出的成果。Veber 等[34]將肺炎鏈球菌P4241 菌株通過氣管注射法構建出小鼠急性肺炎模型,在此模型基礎上對各抗生素療效進行了比較即:阿奇霉素 >螺旋霉素=克拉霉素 >羅紅霉素=紅霉素,這一研究結果為治療急性肺炎的治療提供了有利的理論依據,對治療急性肺炎是一項里程碑式的結果;Wang 等[35]在小鼠DSS 急性潰瘍性結腸炎模型中證明,中藥方劑葛根芩連湯可以提高產短鏈脂肪酸腸道微生物的菌落豐度來調節腸道Treg/Th17 平衡從而緩解急性潰瘍性結腸炎的癥狀,這項研究為結腸炎的治療提供了新思路;Geng等[36]通過研究噬菌體vBSM-A1 與vBSP-A2 對金黃色葡萄球菌誘導的小鼠乳腺炎發現其治療效果與頭孢噻夫鈉有相當的治療效果,該發現開創了新型的治療方案,且在日后有望取代抗生素療法從而避免細菌耐藥性的產生。

目前,對于各種炎癥的機制還沒有完全研究透徹且不同小鼠模型都具有不可避免的局限性。因此,為了更加客觀真實的反映炎癥的發生發展,新型動物模型的建立刻不容緩,轉基因小鼠模型因為其更符合動物臨床客觀標準必定是未來發展的趨勢。此外在構建所需動物模型過程中,前人的造模方法以及用藥劑量僅作為參考,在實際實踐工作中需以此為基礎在不斷發現以及探索的過程中找到與自己所處實驗環境以及實驗內容相契合的方式以及劑量。本文著重介紹了肺炎模型、結腸炎模型、乳房炎模型近幾年的造模方法研究進展,以期為后續科研工作者的研究帶來便利以及參考。