非編碼RNA 在擴張型心肌病中的研究進展

黎偉文 鄧少東 陳建英?

(1.廣東醫科大學附屬醫院 結構性心臟病專科,廣東 湛江 524001;2.廣東醫科大學附屬東莞第一醫院 中醫科,廣東 東莞 523710;3.廣東醫科大學 第二臨床醫學院,廣東 東莞 523808)

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是一種不可逆轉的心肌疾病,其特征為左心室增大和收縮功能障礙,從而導致心臟泵血功能降低,最終進展為心力衰竭(heart failure,HF)甚至死亡。DCM具有異質性,與遺傳異常、病毒感染、心肌炎癥和其他病因有關[1-2],但其發病機制尚不明確。因此,探究與DCM 相關的致病基因及其作用機制對防治具有重要意義。據報道,非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)包括微RNA(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和環狀RNA(circular RNA,circRNA)參與調控心肌發育、分化、代謝、死亡及重構等病理生理過程[3]。筆者查閱了近五年的相關研究論文,對ncRNA 在DCM 中的作用及調控機制展開綜述。

1 DCM 相關ncRNA 的表達譜分析

微陣列和RNA 測序(RNA sequencing,RNA-seq)作為轉錄組學研究的革命性工具,可以通過分析與特定疾病相關的差異表達基因(differentially expressed genes,DEG)來鑒定標志物,而且有助于發現參與疾病的信號通路及調控機制。目前,針對全轉錄組和特定ncRNA 組的檢測和分析已廣泛應用于DCM 的研究中,但具體作用機制有待進一步明確。

1.1 DCM 相關小RNA

miRNA 是一種小RNA 分子,被預測在轉錄后水平調節近30%的基因表達,并與真核生物的發育和代謝廣泛相關[4-5]。miRNA 在各種心血管疾病的發生和發展中也發揮著重要作用,如心律失常、心臟肥厚、心肌纖維化、動脈粥樣硬化、心肌梗死等[6]。最近,Huang 等[7]用小RNA 測序分析發現DCM 患者外周血中48 個表達失調的miRNA 可能通過調節神經元分化過程和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路參與DCM 的發病機制。Enes 等[8]則使用微陣列檢測到DCM 患兒的血漿miR-618、miR-875-3p、miR-205、miR-194、miR-302a、miR-147 和miR-544 表達水平降低,而miR-518f 和miR-454 表達水平升高。此外,Toro 等[9]采用PCR 驗證攜帶核纖層蛋白A/C(lamin A/C,LMNA)基因致病性突變的家族性擴張型心肌病(familial dilated cardiomyopathy,FDCM)患者的循環miRNA 表達譜,發現突變攜帶者的let-7a-5p、miR-142-3p、miR-145-5p 和miR-454-3p 水平顯著升高。

相較于微陣列和測序需要采集足量數量的樣本并投入較高的成本,應用生物信息學分析方法從數據庫中挖掘已知信息已成為一種節省實驗成本并快速獲取有效信息的手段。Wang 等[10]對GEO數據庫中獲取的基因表達譜數據進行生物信息學分析,發現與DCM 相關的miRNA 包括miR-9、miR-200 家族和miR-30 家族。Huang 等[11]通過分析數據庫中miRNA-mRNA 相互作用網絡來識別DCM 的核心基因和miRNA,發現miR-144-3p、miR-363-3p、miR-9-3p、miR-21-3p、miR-144-5p、miR-338-3p 和miR-770-5p 是重要的調節因子。

以上研究提示,多種miRNA 可能是DCM 的潛在標志物和治療靶點。然而,不同的DCM 的類型以及檢測和分析方法均可能得出不同的結果,因此,需要進一步在更多臨床樣本和疾病模型中驗證這些miRNA 的作用及機制。

1.2 DCM 相關lncRNA

lncRNA 是一組長度>200 nt 且不能編碼蛋白的RNA,通過與miRNA 建立聯系并與蛋白質相互作用來調節與其鄰近或遙遠的靶基因。研究已證實,lncRNA 通過調節心臟發育、體內穩態和再生對心血管疾病的進展發揮關鍵作用[12-13]。2018 年,Haas等[14]通過評估全基因組中結構變異(structural variation,SV)與人類心臟中基因表達的聯系,首次確認DCM 導致HF 相關的SV 包括3758 個lncRNA和1756 個蛋白編碼轉錄本,說明基因遺傳變異引起的lncRNA 表達變化控制表型變異。Huang 等[15]通過病例對照研究發現在DCM 患者中差異表達的循環lncRNA 主要與系統發育、器官形態發生和代謝調節有關。除了關于循環lncRNA 的研究,Li 等[16]取DCM 患者的心臟樣本進行微陣列分析,并鑒定RP11-21.2 和XLOC_014288 等lncRNA 在人心肌細胞、心臟成纖維細胞和心臟微血管內皮細胞中發揮不同的作用,而且可能影響患者的左心室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)。Cai 等[17]研究DCM 患兒外周血中lncRNA 的差異表達情況及其與左心室功能的關系,發 現NONHSAT252242.1、ENST000000596816、NONHSAT 215378.1 和NONHSAT137060.2 在心臟功能不同的患者中存在顯著差異,但研究者未做進一步相關性分析。

最近研究表明,lncRNA 可以與miRNA 相互作用,并通過(competing endogenous RNA,ceRNA)機制間接與mRNA 相互作用[13]。Tao 等[18]發現DCM患者的心臟樣本中miR-144-3p 和miR-451a 下調而miR-21-5p 上調,進一步分析發現,靶向miR-144/451 的兩個 lncRNA (NONHSAT001691 和NONHSAT006358)與DCM 高度相關,此外,靶向miR-21 的 4 個 lncRNA (NONHSAT026953、NONHSAT006250、NONHSAT133928 和NONHSAT041662) 也 與 DCM 顯著相關。Chen等[19]通過研究DCM 相關的心臟lncRNA 表達譜發現8 個候選 lncRNA (FGD5-AS1、AC009113.1、WDFY3-AS2、NIFK-AS1、ZNF571-AS1、MIR100HG、AC079089.1 和EIF3J-AS1)也可能通過ceRNA 機制發揮功能。此外,Qiu 等[20]篩選并驗證了DCM 患者左心室組織差異表達的關鍵 lncNRA 如KB1299A7.2、RP11-13E1.5、AC061961.2、LING01AS1、RP11-557H15.4、AC061961.2、LING01AS1、RP11-1313E1.5 等主要與DCM 的疾病狀態和進展有關。

此外,Charles 等[4]通過從NCBI SRA 數據庫中挖掘信息構建的ceRNA 網絡中鑒定出3 個主要樞紐節點,包括lncRNA(XIST)、miRNA(hsa-miR-195-5p)和mRNA(neuro oncological ventral antigen 1,NOVA1)。

以上研究揭示DCM 中lncRNA 的作用極其廣泛,提示其既可作為DCM 的標志物也是影響DCM病理生理的關鍵因素,但是迄今僅有少數研究者做了后續研究,大多數差異表達lncRNA 的功能仍然未知,因此值得進一步探究。

1.3 DCM 相關circRNA

circRNA 與包含5’和3’端的線性RNA 不同,其具有共價連接端,形成一個閉合連續環。由于環狀結構,circRNA 對RNA 酶(RNase)的降解具有抵抗力,因而比其他RNA 更加穩定。circRNA 在調節轉錄、轉錄后、翻譯和翻譯后水平的基因表達中發揮重要作用。最近,circRNA 的ceRNA 功能已成為一個研究熱點。Lin 等[21]用來自DCM 患者和健康對照組的心臟樣本通過RNA-seq 分析揭示,差異表達circRNA 調控的mRNA 與細胞大分子代謝、蛋白質修飾、細胞信號轉導和蛋白質結合有關。Sun等[22]使用RNA 微陣列結合PCR 驗證檢測出DCM患兒外周血中circ_0067735 和circ_0069972 下調而circ_0070186 上調,其功能主要與心肌肥厚、重構、纖維化和自身免疫有關。此外,Dong 等[23]從NCBI SRA 數據庫中獲取信息,分析出參與DCM 異常調控的circALMS1_6 與miR-133 的結合潛力最高。

以上研究表明,circRNA 也同樣地在DCM 中發揮復雜作用。然而,目前關于circRNA 與DCM 之間的聯系缺乏更深入的臨床驗證及機制研究,亟待今后研究來填補此空白。

2 ncRNA 作為DCM 標志物的潛力

轉錄組學數據表明差異表達的ncRNA 可能參與DCM 的發病過程,因此三種主要的ncRNA 理論上均可以作為DCM 的標志物,雖然circRNA 具有比miRNA 和lncRNA 更穩定的結構,但迄今為止僅有miRNA 和lncRNA 被報道,主要體現為對DCM 診斷和預后的預測價值(見表1)。檢測樣品可以來源于患者的外周血或心肌組織,相比而言,心肌組織的特異性更高,但對外周血進行檢測更為方便快捷,因此,循環ncRNA 作為一種非侵入性的生物標志物具有良好的應用前景。

表1 ncRNA 在DCM 診斷和預后預測中的作用Table 1 Roles of ncRNA in the diagnosis and prognosis of DCM

2.1 ncRNA 的診斷價值

miRNA 和lncRNA 都是外泌體攜帶的主要成分由于,外泌體能夠保護其免被血液中的RNase 降解,因此二者可均作為潛在的DCM 標志物用于更準確的早期和鑒別診斷。Wang 等[24]檢測出DCM 患者血漿中顯著升高的miR-3135b、miR-3908 和miR-5571-5p 有較好的診斷潛力,而且miR-5571-5p 水平升高與DCM 的嚴重程度有關。Wu 等[25]發現,DCM并發急性心力衰竭患者的血清外泌體miR-92b-5p表達增加,并可作為DCM 并發急性心力衰竭的潛在生物標志物。Jiao 等[26]證實,DCM 患兒的循環miR-142-5p、miR-143-3-3p、miR-27b-3p 和miR-126-3p 可能是診斷兒童DCM 和評估HF 的潛在生物標志物,重要的是,miR-126-3p 增加與LVEF 呈顯著負相關。最近,Zaragoza 等[27]研究表明,與FDCM 突變致病基因Bcl2 關聯永生基因3(Bcl2 associated athanogene 3,BAG3) 相關的循環miR-154-5p 和miR-182-5p 組合具有診斷價值,然而進一步研究將需要長期隨訪,并擴大人群進行驗證。此外,Toro等[9]證實,let-7a-5p、miR-142-3p、miR-145-5p、miR-454-3p 以及它們的組合可以區分健康人、DCM 表型陰性的LMNA 基因突變攜帶者和LMNA 相關的DCM 患者。關于lncRNA 作為DCM 診斷標志物的研究較少。Zhang 等[28]構建了基于ceRNA 網絡中6個 lncRNA (AC016722.3、AL589986.2、AC006007.1、AC092687.3、GS1-124K5.4 和AC007126.1)的多元Logistic 回歸模型,證實這些lncRNA 在訓練集和驗證集中均顯示出對DCM 診斷的高靈敏度和特異性。Luo 等[29]則利用生物信息學方法獲得了107 個有潛力的lncRNA,并鑒定出中上調的IDI2-AS1 和下調的XIST 對DCM 均具有良好的診斷價值。這些研究提示,無論上調還是下調的ncRNA 都可作為DCM 的新型診斷標志物,而且單用和聯用均具有較好的診斷價值。

除了 DCM,缺血性心肌病 (ischemic cardiomyopathy,ICM)也是引起HF 的一個主要原因,因此需要在分子水平進行鑒別。Lin 等[21]應用微陣列分析DCM 和ICM 患者的循環lncRNA 表達譜,發現3,222 個lncRNA 具有顯著差異。但是該研究未擴大樣本量驗證相關lncRNA 的鑒別診斷能力。此外,Brundin 等[30]研究發現,循環miR-320a增加DCM 患者與健康對照之間的鑒別,而循環miR-29-5p 則增加DCM 與缺血性心臟病之間的鑒別。由于目前的研究有限,將來有必要篩選更多有效標志物用以鑒別診斷DCM 和其它類型心肌病。

2.2 ncRNA 的預后價值

B 細胞通過誘導心肌細胞損傷和心肌纖維化,促進DCM 的發展,Yu 等[31]曾報道,miR-185 參與人類B 細胞的激活。后續研究顯示,DCM 患者血漿miR-185 的平均水平明顯高于健康對照組,而且高表達miR-185 患者的LVEF、左心室舒張末直徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)和腦鈉肽前體(N-terminal pro-B type natriuretic peptide,NTproBNP)有顯著改善,心血管死亡率和HF 再入院率顯著下降,可能與抗β1-腎上腺素能受體(β1-adrenoceptor,β1-AR)抗體和分泌腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的B 細胞水平降低有關[32]。此外,Rubis' 等[33]研究與纖維化相關的miRNA 是否與DCM 的心血管結局相關,發現DCM 與循環冠狀動脈旁路移植術患者心肌中的miR-26、miR-29 和miR-133a 表達水平存在差異,而相應的循環和心肌miRNA 之間不相關,循環miRNA 均不是聯合終點的預測因子,而心肌miR-133a 卻是獨立的預測因子。這些研究提示,miRNA可能通過調節炎癥和纖維化影響DCM 的預后。

lncRNA 參與心血管疾病的發病機制,因此也可作為DCM 的預后生物標志物。Zhang 等[34]評估循環lncRNA 水平與DCM 患者的HF 嚴重程度之間的相關性,發現 ENST00000507296 和ENST00000532365 與心臟功能顯著相關,并可在至少一種人類心臟源性細胞中檢測到二者表達,重要的是,循環ENST00000507296 低水平與DCM 患者的高生存率相關,因此可作為DCM 患者預后的生物標志物。胰島素樣生長因子-1(isulin-like growth factor 1,IGF-1)信號在終末期DCM 中受到抑制,Cheng 等[35]研究分析IGF-1 和HAND2-AS1 水平之間的相關性,發現終末期DCM 患者的血漿IGF-1 和HAND2-AS1 水平明顯低于健康對照組,隨訪研究顯示,低水平的IGF-1 或HAND2-AS1 與低生存率具有顯著相關,提示HAND2-AS1 可能參與終末期DCM。但是該研究未闡明IGF-1 與HAND2-AS1 之間的關系。總而言之,lncRNA 作為DCM 的預后標志物在調控機制方面仍存在很大的未知空間。

3 ncRNA 作為DCM 治療靶點的潛力

迄今,關于ncRNA 在DCM 中的作用和機制研究較少,文獻報道其主要與心肌細胞死亡、心肌重構和免疫炎癥有關(見表2),因此可能作為DCM 治療的潛在靶點。

表2 ncRNA 在DCM 病理生理中的調控作用Table 2 Regulatory roles of ncRNA in DCM pathophysiology

3.1 ncRNA 對心肌細胞凋亡的影響

DCM 與心源性猝死和HF 有關,但關于DCM 的發病機制仍不明確。Wang 等[36]觀察到DCM 患者的心臟組織中存在廣泛的纖維化和細胞凋亡,且B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)表達顯著增加,此外,miR-21上調而miR-29 家族(miR-29a、miR-29b 和miR-29c)和miR-133 家族(miR-133a 和miR-133b)下調,表明Bcl-2 和特異性miRNA 可能參與DCM 的發病機制,并可能作為治療靶點。Calderon-Dominguez 等[37]檢測發現缺血性擴張型心肌病(IDCM)患者的血漿miR-16 表達水平上調,進一步在體外實驗中證實miR-16 過表達增加心肌細胞凋亡,與其上調蛋白激酶 R 樣內質網激酶(PRKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)/C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)通路從而誘導內質網應激有關。

lncRNA 的表達水平改變可能影響DCM 的病理進程,然而,其作用的詳細機制需要進一步研究。Chen 等[19]曾報道,DCM 患者的 lncRNA AC061961.2 下調。最近,Qiu 等[38]繼續研究AC061961.2 對DCM 的影響,發現阿霉素誘導大鼠DCM 模型的心臟組織中細胞凋亡有所增加而AC061961.2 表達減少,進一步研究證實,AC061961.2 通過激活Wnt/β-鏈蛋白(β-catenin)通路抑制內質網應激介導的DCM 大鼠心肌細胞凋亡。Gabory 等[39]則在同樣的DCM 模型中發現,lncRNA H19 在心肌組織中的表達顯著上調。Zhang 等[40]在此基礎上進一步探討H19 在阿霉素誘導DCM 中的潛在作用機制,研究結果顯示,H19 敲除可降低心肌細胞凋亡,H19/miR-675 軸通過靶向增殖關聯蛋白2G4(PA2G4)促進心肌細胞凋亡,該作用機制可為阿霉素誘導DCM 提供了一種新的治療策略。

以上研究表明miRNA 和lncRNA 均參與調節DCM 心肌細胞凋亡,而且兩種ncRNA 之間存在一定聯系,因此靶向調節相關信號軸可能比單一靶向具有更好的改善效果。

3.2 ncRNA 對心肌重構的影響

已有研究表明,抑制miR-208a 可以改善HF 小鼠的心臟功能和生存率[41]。Zhou 等[42]應 用miRNA 微陣列分析發現DCM 小鼠和DCM 患者心肌的miR-208b 表達上調,進一步研究其對心臟重構的影響,發現miR-208b 過表達會導致心臟肥厚,ETS 類轉錄因子則是miR-208b 的潛在靶點,提示miR-208b 在心臟發育和生長中起重要作用。該研究表明,miR-208b 通過轉錄后基因表達調控參與DCM 的心肌重構過程和發病機制,因此miR-208b可能是DCM 的一個新治療靶點。此外,Rubis' 等[43]發現外周血中與纖維化相關的miRNA 包括miR-21、miR-26、miR-29、miR-30 和miR-133a 在DCM 患者與對照組之間存在顯著差異,但在新發和慢性以及心肌纖維化和非心肌纖維化的DCM 患者中表達相似,其中miR-26 與胞外基質纖維化相關,miR-26和miR-30 與膠原體積分數相關,miR-133a 與細胞外基質代謝相關,miR-26 和miR-133a 與纖維化相關。但是該研究未在細胞或動物實驗模型中進一步探討miRNA 的作用機制。

3.3 ncRNA 對免疫炎癥的影響

CD4+T 細胞在DCM 患者中異常激活,可能與該疾病的免疫發病機制有關。Zeng 等[44]研究miRNA 失調是否與DCM 中CD4+T 細胞的激活有關,發現DCM 患者的CD4+T 細胞中miR-451a 水平顯著降低,而miR-451a 下調通過靶向轉錄因子Myc促進DCM 患者的CD4+T 細胞激活和增殖,因此,調控CD4+T 細胞中的miR-451a 表達可能成為一種治療DCM 的新方法。研究表明,心肌球來源細胞(cardiosphere-derived cells,CDC)能改善生理性單心室患者的心功能和預后,Hirai 等[45]確定CDC 在豬DCM 模型中的安全性和有效性后,在I 期臨床試驗中進一步評估了CDC 治療的安全性和對心功能的影響;進一步的機制研究揭示,CDC 改善心功能并減輕心肌纖維化歸功于其外泌體攜帶的miR-146a-5p 可抑制促炎細胞因子,此外,通過轉錄組學分析鑒定出CDC 來源外泌體中顯著富集的miRNA 主要包括miR-126-5p、miR-132、miR-146a-5p、miR-181b、miR-210 和miR-451,提示其可能通過激活內源性心臟修復機制誘導抗纖維化、抗凋亡和促血管生成。

4 總結與展望

不同類型的ncRNA 在DCM 中發揮不同的作用,而且它們之間也存在著相互作用。此外,樣本來源不同以及DCM 的復雜病因均可能影響轉錄組學結果,因此,大樣本多中心臨床研究和生物大數據分析都是必要的。雖然ncRNA 的作用廣泛,但目前關于其影響DCM 發生、進展和轉歸的機制仍知之甚少。目前關于ncRNA 與DCM 的大多數研究僅停留在轉錄組學和生物信息學分析階段,大樣本驗證及更深入的機制研究不夠,目前功能較為明確的多是miRNA,lnRNA 的研究相對較少,而cicRNA 的作用和機制幾乎未知。因此,今后的研究應結合臨床和生物信息學數據并通過基礎研究深入挖掘ncRNA 的作用機制,從而尋找更多有效的潛在標志物和治療靶點。此外,DCM 的異質性決定該疾病的發病機制極其復雜,在研究ncRNA 的調控機制時需要進一步對該疾病從病因上進行細分。