利用糞腸球菌感染根管模型評價不同根管封閉劑的抗菌效果

李克朋，程甜甜，仇 珺，尤蘇霞，蔣文凱，梅笑寒

Stomatology,2022,42(1):42-46

糞腸球菌是難治性根尖周炎中最常見的細菌之一，以往研究證明糞腸球菌可滲入牙本質小管內深達1 000 μm處，而常規機械預備僅能清除75 μm左右的感染牙本質壁，即使用最先進的激光輔助技術配合化學沖洗劑進行根管蕩洗也僅能清除大約500 μm處的細菌[1]。慢性根尖周炎可能導致根尖吸收，破壞原始根尖孔，或阻礙年輕恒牙根尖孔的發育導致根尖區外敞，常規根管預備器械較難形成有效切割，并且根管充填時無法有效三維封閉根尖區，引起根尖微滲漏，導致根管治療失敗[2]。根尖屏障術通過人為即刻形成根尖封閉區，在縮短治療周期的同時提高根管充填的嚴密性[3]。如果根管封閉劑本身就具有抗菌作用，將有助于清除根管預備后仍在牙本質小管內存活的殘留微生物[4]。

生物陶瓷類根管封閉劑被引入根管治療后，作為一種替代性根管封閉劑，具有優越的生物和理化特性[5]。與其他根管封閉劑相比，生物陶瓷類封閉劑具有更好的生物相容性，細胞毒性和微滲漏也顯著降低[6]。由于其生物活性，封閉劑可形成羥基磷灰石促進硬組織沉積[7]。此外，它具有阻射性、親水性、凝固后膨脹、不溶性、抗菌性等優越的性能[8]。然而在牙本質根管表面附著生物膜的實驗環境中，關于生物陶瓷封閉劑的抗菌效果，尚罕見報道。

本研究通過體外建立根管感染模型，評估使用Biodentine(賽普頓，法國)、iRoot BP(Innovative, Bioceramics，加拿大)、MTA(Dentsply，德國)3種生物陶瓷類根管封閉劑進行根尖屏障術后對糞腸球菌的抗菌作用，為臨床治療中根管封閉材料的選擇提供參考

1 材料與方法

1.1 離體牙的處理

2020年7月—12月由第四軍醫大學口腔醫院齒槽外科門診拔除的離體恒牙中選擇未做過牙髓治療且根管粗大的單根牙齒作為實驗樣本，拍攝X線片確定根管影像清晰無鈣化或內吸收。使用高速手機金剛砂車針(Hitachi，日本)磨除釉牙骨質界以上的牙冠，保留至少12 mm長度的牙根。拔髓針去除根管內大塊牙髓組織，使用15#K銼(K-file，MANI公司，日本)疏通根管。將牙齒依次放置于含有35 mL 17%EDTA溶液(上海生工生物工程有限公司)(pH=7.2)和5.25%次氯酸鈉溶液(天津天力化學試劑有限公司)的離心管中，滅菌、培養，具體方法同先前的實驗[9]，之后通過掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)(S-4800, Hitachi，日本)進行觀察，確認根管壁上的玷污層已被去除，并無細菌生長。

1.1.1 根管內糞腸球菌的接種與培養 選擇由第四軍醫大學第三附屬醫院微生物實驗室提供的糞腸球菌標準菌株(菌株號：ATCC29212)，接種于BHI瓊脂培養皿中，在37 ℃ CO2培養箱(Don Whitley Scientific Limited，英國)中孵育24 h使其復蘇，挑取單克隆菌株在BHI平板上再次傳代培養24 h。挑選菌株并將其放入BHI液體培養基中，用麥氏比濁儀(Becton Dickinson&Company，美國)將細菌密度調整至0.5(約1×108CFU/mL)。每個離心管內加入1 mL菌液，并將離體牙放入其內，每管1顆，在37 ℃恒溫瓶中培養4周，每2 d換液1次。細菌培養完成后，隨機選取5個樣本，SEM觀察以確認已成功建立糞腸球菌根管感染模型，用于以下實驗。

1.1.2 根管成形和沖洗 取出感染根管樣本，使用根管單支銼(Waveone Gold，登士柏西諾德公司，瑞典)進行根管成形，冠向下法預備至40.04#，再使用不銹鋼K銼將根尖寬度逐級預備至70#，終末沖洗使用5.25%次氯酸鈉和17%乙二醇四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)配合超聲(P5 Newtron，ACTEON賽特力，法國)輔助蕩洗根管各1 min，紙捻干燥根管后備用。

1.1.3 根管充填 將所有樣本分為以下5組：A組，Biodentine；B組，iRoot Bp；C組，MTA；D組，陽性對照組：熱熔牙膠充填；E組，陰性對照組：無菌根管。A～D組n=20，E組n=5。臨床操作采用隨機雙盲法由2名實驗者共同完成，實驗前均進行Kappa標準一致性檢驗，檢驗結果Kappa值為0.81，證明完全可靠。

牙科顯微鏡(OS2350，速邁，中國蘇州)下用垂直加壓器將Biodentine、iRoot BP、MTA封閉劑分別輸送至根管內，垂直加壓至根尖4 mm制成根尖屏障，并保證封閉劑覆蓋根管壁，熱熔牙膠回填根管中上段，垂直加壓器壓平材料。充填后，將全部樣本在37 ℃厭氧條件下培養。

1.2 細菌計數

實驗方法同課題組之前的辦法[9-10]，在充填根管后第1、3、7和14天時，分別從每組中取出5個樣本做細菌計數：①磨除根充材料和牙本質碎屑(平均質量為(35±5)mg)，均勻混合于PBS溶液(每個離心管中2 mL)；②將細菌懸液按1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4從高到低梯度稀釋，每個梯度各取50 μL菌液均勻涂布于膽汁七葉苷瓊脂培養皿表面，37 ℃厭氧條件下靜置培養；③孵育24 h后，分別觀察每個培養皿上菌落形成情況并進行細菌計數；④計數結果取平均值后，乘以相應的稀釋倍數得出每毫升CFU，制作CFU/mL(y軸)與時間(x軸)的對數關系圖。

1.3 統計學方法

使用SPSS 20.0軟件對數據進行方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05，P>0.05 則被視為無統計學意義。

2 結 果

2.1 掃描電鏡結果

離體牙樣本經次氯酸鈉和EDTA處理后可見牙本質小管清晰、開放，未見玷污層及明顯細菌(圖1)。經過細菌培養后離體牙牙本質小管內可見大量糞腸球菌附著，形態飽滿均勻，形成生物膜，且牙本質小管深層約300 μm處亦可見細菌(圖2)，證明成功建立糞腸球菌感染根管模型。

A1： ×1 000； A2： ×2 000

B1： ×1 000； B2： ×5 000； B3： ×100； B4： ×5 000

2.2 細菌計數結果

實驗結果顯示：3個實驗組在4個時間點上均表現出對糞腸球菌的抗菌能力，與對照組相比有統計學差異(P<0.05)，細菌數目依時間遞減，第14天時各實驗組的細菌數目與第1、3天相比，均有顯著性差異(P<0.05)。同一時間點內各實驗組組間殺菌效果無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

不同大寫字母表示同一時間點組間有顯著性差異，不同小寫字母表示組內不同時間點有顯著性差異，P<0.05

3 討 論

根尖周炎是發生在牙齒根尖周組織的炎癥性疾病，細菌及其產物是導致牙髓壞死進而誘發根尖周感染的最主要因素之一[11]。根管機械預備和化學預備不能完全清除根管內所有致病菌，嚴密的根管充填成為有效控制感染的最后一道屏障。根管充填一方面可利用根管封閉劑包裹或隔離殘留于牙本質小管內難以清除的病原體，使其失去營養從而喪失致病性，另一方面還可以三維封閉根尖孔和側副根管，使病原體無法侵入根管系統，從而有效防止再感染。理想的根尖封閉材料應具備殺菌性或抗菌性[12]。這是因為作為原發性感染主要成分的細菌可以與持續感染區域中的抗體一起存在。在根管充填后持續感染的根管內，糞腸球菌的檢出率最高[13]，據報道糞腸球菌可在無營養的根管內存活達12個月[14]。因此本研究評估和比較了MTA與新型根管封閉劑Biodentine和iRoot Bp的抗菌效果。以往研究通常使用瓊脂擴散法(agar diffusion test，ADT)和直接接觸法(direct contact test，DCT)對根管封閉劑的抗菌性能進行檢測[9]。ADT可反映檢測材料的擴散能力而不是抗菌能力[15]，所以現在的研究主要以DCT為主要研究方法，這種方法可以顯示受試材料與微生物混合幾小時或幾天后的抗菌能力。然而，DCT沒有考慮到牙本質的存在和復雜性根管解剖結構或生物膜帶來的潛在影響[16]。細菌侵入牙本質小管后，形成生物膜，將有效抵御封閉劑的抑菌作用[17]。多項研究證明體外建立糞腸球菌根管感染模型是目前有效檢測深度感染牙本質小管中封閉劑抗菌性能的實驗方法[18]。因此，本實驗建立糞腸球菌根管感染模型，在擴大根管前將細菌植入根管內，模擬臨床中慢性根尖周炎的治療過程——對根尖孔粗大的感染根管進行根管預備、沖洗消毒、根尖封閉、根管充填。較以往的根管感染模型不同[19]，本實驗模型最大程度還原了對于難治性根管的治療過程，以期更準確評估抗菌效果。

根管充填材料種類繁多，MTA因其具有再生和成骨潛能、良好的邊緣封閉能力、生物相容性和生物活性等優點，并且隨時間推移，其抗壓力性逐漸增強，因此被認為是最理想的根管封閉劑[20-21]。已有研究證實MTA因其堿性特質對大腸桿菌和糞腸球菌具有抗菌作用[22]。新調拌好的MTA pH值為10.0，2～3 h后增加至12.5，這可能是由于水化過程中氫氧化鈣釋放所致[23]。然而先前的研究對MTA的抗菌能力有爭議，例如一些研究表明MTA的抗菌能力有限。此外，還有研究證明 MTA的抗菌效果取決于根管預備的形態[24]。這可能歸因于使用不同的實驗方法、菌株和好氧或厭氧培養條件。Biodentine和iRoot Bp是基于“生物活性硅酸鹽技術”推出的一種根管修復材料，其生物相容性、生物活性、封閉性、再生能力都與MTA相似，但固化時間和操作性能更優于MTA[25]。當它們與牙本質和根尖周組織中的液體接觸時，會產生硅酸鈣和氫氧化鈣，pH值可升至12.5。已有研究證實氫氧化鈣可破壞細胞膜并影響細菌營養的供給，強堿環境使微生物的生長受到明顯抑制，阻礙細菌正常代謝、生長和細胞分裂。此外，生物陶瓷材料內所含的氧化鋯也具有一定抗菌活性，可通過氧化還原反應對兩種革蘭氏陽性菌產生抑制作用[6]。還有學者對Biodentine的抗壓強度、彈性模量、顯微硬度等性能進行了研究，結果表明它具有與天然牙本質相似特性，因此被認為是理想的根管修復材料[26]。

本研究證明Biodentine、iRoot Bp和MTA固化后有相似的抗菌能力，并且隨著時間的延長，它們對糞腸球菌的抗菌效果呈遞增趨勢，封閉14 d后細菌數量與封閉前相比較減少了1/2。而在同一時間點3種材料的抗菌性無明顯差異。在之前的體外研究中，Liu等[27]使用DCT檢測iRoot Bp和MTA的抗菌性能，結果表明兩種材料均可有效殺滅糞腸球菌，而抗菌性能無明顯差異。Koruyucu等[28]用直接接觸實驗測試了Biodentine、MTA、Dycal 3種直接蓋髓劑不同固化時間對糞腸球菌的抑菌性，結果表明即刻調拌好的MTA抗菌效果最佳，1周時MTA的抗菌效果略高于Biodentine，無統計學差異。Kadam等[12]利用瓊脂擴散實驗研究了Biodentine和MTA對糞腸球菌抗菌效果，結果表明Biodentine與MTA均可產生抑菌環，而Biodentine獲得了更大的抑制區，這表明其具有更強的抗菌活性。不同的實驗方法結果雖不盡相同，但均證明Biodentine和iRoot Bp具有長期的抗菌效果，與本實驗結果基本一致。

綜上所述，Biodentine和iRoot Bp與MTA具有相當的抗菌活性，當患有根尖周炎的患者根尖區開放時，經過充分的機械及化學預備后，臨床中可以考慮使用Biodentine或iRoot Bp這兩種生物陶瓷類根管封閉劑進行根尖屏障術，以減少MTA臨床操作中帶來的不便，提高操作效率。