新疆藥桑葚酵素發酵動力學模型及其發酵比速率的研究

呂明珊，袁藝洋，邢軍，王亮，茹先古麗·買買提依明，艾合買提江·艾海提*

(1.新疆大學 生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046；2.華南農業大學 食品學院，廣州 510642)

新疆藥桑，屬桑科(Moraceac)、桑屬(MorusL.)、黑桑種(MorusnigraL.)，是新疆特有生長環境下的原始桑種資源[1]。藥桑葚是其成熟果實，性寒、無毒，有消炎、補血、鎮靜等功效，對治療耳眼不靈、內熱消渴、精神狀態不佳、便秘、風濕導致的關節疼痛均有療效[2]。桑葚是一種營養豐富的漿果果實，其富含多酚類化合物[3-4]，有研究表明新疆藥桑葚的營養成分如多糖、黃酮[5]含量都高于其他桑葚。現今，由果蔬汁經乳酸菌發酵得到的酵素產品逐漸受到眾人的關注。果漿在經過發酵后富含各種有機酸[6]、多酚類化合物、超氧化物歧化酶等。且果蔬汁經過發酵后較好地豐富了其原本的口感，發酵時產生的發酵產物還能起到調節腸道菌群、促進消化、抗炎、抗氧化[7]等作用。

目前，以藥桑葚為原料的產品有藥桑罐頭、藥桑果汁、果酒、果醋和果醬等，但藥桑葚酵素這種生物發酵制品卻極為罕見，與之相關的文獻也寥寥可數，并且對于藥桑葚酵素發酵動力學的研究也未見報道。藥桑葚果味濃厚、香氣濃郁，含糖量及總酸含量均高于其他桑葚，但是藥桑葚果實屬于季節性收獲的，結構脆弱且極易受到擠壓和易腐爛[8]，不過這些看似不利的條件使藥桑葚有著非常杰出的發酵基礎。利用藥桑葚制成酵素不但能滿足人們對于營養和保健的需求，還能解決藥桑葚貨架期短、不易運輸等問題[9]。本實驗通過對藥桑葚酵素發酵動力學的研究，對探索和優化藥桑葚酵素混菌發酵的優良釀造工藝、混菌發酵酵素的擴大化生產和質量把控及市場開發有著積極的意義。

在食品發酵領域，研究者們采用數學模型來描述和預測發酵過程中的菌密度、生成物濃度和底物濃度等主要代謝指標的變化規律，例如，Logistic 模型[10]、SGompertz[11]模型和Boltzmann模型[12]，從而為發酵液的發酵過程工藝優化、實驗室轉工業生產實現數據的放大提供了理論基礎。本研究以乳酸菌為發酵菌株，將藥桑葚果漿酶解后進行乳酸菌無氧發酵并測定發酵過程中乳酸菌生長變化、還原糖和總酸含量變化，采用Logistic模型、Boltzmann模型、SGompertz模型和DoseResp模型對藥桑葚酵素發酵過程中菌體生長、總酸生成、還原糖消耗情況進行擬合，并依據相關系數判斷其可靠性，為進一步擴大化生產提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥桑葚：新疆阿克蘇地區庫車市生產；鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)bio-52962、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)bio-114001：中國微生物菌種保藏中心；MRS肉湯培養基：北京奧博星生物技術有限公司；果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶：諾維信有限公司。

1.2 儀器與設備

KX-101恒溫干燥箱、RH-QG全溫振蕩器(搖床) 江蘇科析儀器有限公司；DHP-9052恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；1004分析天平 上海越平科學儀器有限公司；LS-150LD立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫療設備有限公司；SW-CJ-2G超凈工作臺 上海滬凈醫療器械有限公司；UV752紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥桑葚酵素工藝流程

新鮮的藥桑葚→預處理→破碎機打漿→酶解→85 ℃滅酶30 min→冷卻至37 ℃→菌種經活化擴大培養后接種→37 ℃恒溫搖床內發酵→終止發酵(110 ℃滅菌20 min)→室溫下冷卻→生產線罐裝→4 ℃冰箱內儲藏。

1.3.1.1 菌種活化及培養

乳酸菌：MRS液體培養基，于37 ℃恒溫培養箱培養乳酸菌24 h，將乳酸菌繼續傳代2次，備用。

1.3.1.2 藥桑葚發酵液的發酵過程

選取紫色成熟的藥桑葚，剔除病害部分。使用破壁機打漿，將果汁放入1000 mL三角瓶中，酶添加量0.4 °Brix(果膠酶∶纖維素酶∶半纖維素酶為2∶1∶1)，然后放置在55 ℃恒溫水浴鍋內酶解3.5 h，85 ℃滅酶30 min，冷卻至37 ℃接種，在1 L補料瓶內接種，接種量為藥桑葚發酵液內菌密度6×106CFU/mL。密封隔絕空氣進行厭氧發酵定時于無菌室超凈間內取樣檢測。

1.3.2 乳酸菌計數

在無菌操作臺內將發酵液取出0.5 mL用無菌水稀釋10倍，用無菌移液槍移取稀釋發酵液滴于血球計數板上，在光學顯微鏡下計數。

1.3.3 總酸含量測定

參照GB 12456-2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》測定總酸含量[13]。

1.3.4 還原糖含量的測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖的質量濃度[14]。葡萄糖標準曲線回歸方程：y=5511x-0.0126，相關系數R2=0.9993。

1.4 數據處理與分析

1.4.1 數據處理

每組實驗重復3個平行，結果取其平均值，采用 Origin 9.0 對數據進行統計和作圖分析，選取合適的動力學模型對乳酸菌體生長、還原糖基質消耗和總酸產量生成情況進行非線性擬合，并利用每個模型的擬合系數R2作為可靠性評價標準來篩選出擬合度高的動力學模型進行定量描述。

1.4.2 發酵動力學模型

乳酸菌菌體生長動力學模型擬合：乳酸菌菌體的生長呈S形曲線，故采用Logistic、SGompertz和 DoseResp模型進行非線性擬合，選取擬合系數R2最大的模型用于描述乳酸菌體生長規律。

總酸產量生成動力學模型擬合：有機酸是乳酸菌轉化糖類代謝而生成的產物。有機酸生成速率與乳酸菌生長速率的相關性屬于生長偶聯型，其增長曲線呈現出與乳酸菌菌體生長相似的S形曲線，故選用Logistic、SGompertz和DoseResp模型對其進行非線性擬合，選用擬合系數最大的模型描述總酸產量生成。

還原糖含量消耗動力學模型擬合：乳酸菌發酵藥桑葚酵素過程中，還原糖在乳酸菌發酵過程中主要被轉化成乳酸等有機酸，因此選用模型中的Logistic、Boltzmann和DoseResp模型進行非線性擬合，選用擬合系數R2最大的模型描述還原糖消耗情況。

2 結果與分析

2.1 藥桑葚酵素發酵過程中乳酸菌密度、還原糖含量和總酸含量變化趨勢

乳酸菌混菌發酵藥桑葚果漿過程中，乳酸菌數、還原糖含量和總酸含量變化見圖 1。

圖1 藥桑葚酵素發酵過程中乳酸菌生長、還原糖基質含量和發酵液內總酸含量變化趨勢Fig.1 The change trend of lactic acid bacteria growth, reducing sugar substrate content and total acid content of fermentation liquid during the fermentation process of Morus nigra L. enzyme

由圖1可知，發酵初期6 h前，乳酸菌產酸速度緩慢，發酵4～6 h，還原糖消耗2.43 g/L，總酸增長0.21 g/L，這可能是因為乳酸菌進入新的生長環境需要適應與培養基不同的pH和單糖濃度[15]。酵素發酵6 h后，乳酸菌生長進入指數期，還原糖迅速在2 h內消耗11.07 g/L，總酸含量在2 h內迅速增加了0.44 g/L。經歷指數生長期后，發酵時間16 h末時生物量從初始值5×106CFU/mL增加到最高值8.47×108CFU/mL。發酵液中的還原糖含量從初始值123.33 g/L降至90.12 g/L，從而使有機酸產生，總酸從初始值26.17 g/L增加至27.79 g/L。16 h后由于還原糖含量下降，總酸含量過高，pH值過低，抑制菌群生長，乳酸菌比生長速率下降，乳酸菌于18 h后進入穩定期，乳酸菌數量最高達8.66×108CFU/mL。

2.2 藥桑葚酵素發酵動力學模型的建立

2.2.1 乳酸菌菌體生長動力學模型

乳酸菌數在不同模型下的擬合方程及擬合系數見表1。Logistic 模型、SGompertz 模型和DoseResp 3種模型對乳酸菌菌體生長情況的非線性擬合結果見圖2。

表1 乳酸菌生長擬合方程及相關系數

由表1可知，擬合模型的相關系數R2值均接近1，其中Logistic模型的相關系數R2=0.99975，SGompertz 模型的相關系數R2=0.99945，DoseResp模型的相關系數R2=0.99925。最接近1的Logistic模型能更好地預測藥桑葚酵素中乳酸菌的生長狀況，其擬合曲線見圖2中a。

a.Logistic模型擬合曲線

2.2.2 還原糖基質消耗動力學模型

采用Logistic模型、DoseResp模型和 Boltzmann 模型對藥桑葚酵素發酵過程中還原糖基質消耗情況進行擬合，擬合曲線見表2和圖3。

表2 還原糖消耗擬合方程及擬合系數Table 2 Reducing sugar consumption fitting equation and fitting coefficient

a.Logistic模型擬合曲線

由圖3可知，3種模型擬合下的還原糖消耗曲線趨勢基本一致，其中DoseResp模型和Boltzmann模型驗證所得參數相同，且其相關系數R2=0.99512相較于Logistic模型的R2=0.9948更接近于1，故DoseResp模型和 Boltzmann 模型均可用于定量描述和預測藥桑葚酵素發酵過程中還原糖基質消耗情況，擬合曲線見圖3中b和c。

2.2.3 總酸含量動力學模型

采用Logistic模型、DoseResp模型和SGompertz 模型對藥桑葚酵素發酵過程中總酸含量的變化情況進行擬合，由表3可知，Logistic模型和DoseResp模型擬合曲線趨勢相似且R2都在0.997以上，SGompertz模型擬合曲線相較前兩種模型擬合效果欠佳，故選用R2最接近1的Logistic模型對藥桑葚酵素發酵過程中總酸生成情況進行定量描述，擬合曲線見圖4中a。

表3 總酸生成擬合方程及擬合系數

a.Logistic模型擬合曲線

2.3 藥桑葚酵素發酵過程中比生長速率、比消耗速率和比增長速率的研究

由圖5可知，在限制性條件下發酵的乳酸菌菌體生長的初期受發酵液pH和底物濃度影響使其菌體生長速度緩慢，適應期結束后菌體生長速度變快，隨后乳酸菌生長的比生長速率達到最大，接著比生長速率逐漸降低甚至菌體停止生長，乳酸菌比生長速率呈鐘形曲線。乳酸菌比生長速率表示每小時單位質量的菌體所增加的菌體量[16]。由圖5可知，酵素內總酸含量的生成與菌體生長顯現出強相關性系，為生長偶聯型關系[17]。由圖1可知，乳酸菌在0～16為快速生長期，隨后進入穩定期，乳酸菌數量隨著發酵時間繼續增加無明顯變化，此時發酵結束。結合圖5還原糖比消耗速率曲線可知，乳酸菌在生長穩定期，其葡萄糖的比消耗速率隨發酵時間的增加而變化，其比消耗速率與乳酸菌比生長速率呈現負相關性。

圖5 藥桑葚酵素發酵過程中比生長速率、還原糖消耗速率和總酸生成速率隨時間的變化曲線Fig.5 The specific growth rate, reducing sugar consumption rate and total acid production rate during the fermentation process of mulberry enzymes with time

3 結論

目前發酵動力學模型在發酵實驗轉小罐生產方面的應用愈發廣泛，但對于藥桑葚酵素相關產品的研究較少，利用多種乳酸菌混菌發酵制備藥桑葚酵素的發酵動力學研究還未見文獻報道，本實驗以新疆藥桑葚為原料，打漿酶解后放入多種乳酸菌進行發酵，發酵液色澤呈紫紅色，果香濃厚，酸甜可口。在藥桑葚酵素發酵過程中對菌生長量、總酸含量和還原糖含量進行測定，在整個酵素發酵過程中菌生長量、總酸含量和還原糖含量互相關聯，發酵進行到6 h后菌生長量迅速增長，總酸含量也隨之增加,而還原糖含量在同一時期下降。發酵結束后(18 h)酵素中還原糖含量降至90.12 g/L，發酵液內總酸含量增加至27.79 g/L。利用Logistic 模型、SGompertz 模型、DoseResp模型和Boltzmann 模型對菌生長量、總酸含量和還原糖含量進行非線性擬合，發現Logistic 模型、DoseResp模型和Boltzmann 模型能夠較好地對乳酸菌生長、總酸生成和還原糖基質消耗進行非線性擬合，并采用相關系數R2對擬合模型進行可靠性評價，所選模型能夠較好地描述藥桑葚酵素的發酵動力學特征。通過對比生長速率、總酸比合成速率與還原糖基質比消耗速率研究，研究三者在整個發酵過程中隨時間的變化情況，可知總酸的生成與菌體生長是生長偶聯型的。研究藥桑葚酵素既解決了藥桑葚不易運輸、難儲存的弊端，又滿足了人們對營養保健方面的需求，研究藥桑葚發酵動力學能了解發酵過程中生理生化及動力學特征，也能反映出酵素發酵過程中底物和產物之間的關系，為藥桑葚酵素工業化生產提供了理論指導，為擴大化生產提供了可能性。