腫瘤蛋白D52在胰腺癌組織中的表達及其臨床意義

王振勇，孟宇，李金超，張雷，石亮，田亮，劉汝海

（河北省滄州市中心醫院，河北 滄州 061000，1.肝膽胰外一科，2.病理科）

胰腺癌早期診斷困難，大部分患者確診時已發展到癌癥晚期，且現有治療手段效果欠佳。為改善胰腺癌治療效果，尋找與胰腺癌相關的癌基因并對其機制進行研究，顯得尤為重要。腫瘤蛋白D52（tumor protein D52，TPD52）在富含分泌顆粒的分泌器官（如胃、胰腺、睪丸及乳腺等）中參與Ca2+依賴型消化酶分泌的調節[1]。目前TPD52參與腫瘤發生、發展及其分子機制受到廣泛關注[2-3]，是近年來被發現的一類原癌基因。關于TPD52表達與胰腺癌關系的研究報道尚少。本研究旨在探討TPD52在胰腺癌組織中的表達及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集自2015年6 月至2020 年6 月于河北省滄州市中心醫院接受根治性手術治療并病理確診的129例胰腺導管腺癌患者石蠟包埋組織標本。所有患者術前均未接受放、化療或其他抗腫瘤治療。收集患者性別、年齡、腫瘤部位及直徑、淋巴結轉移、肝轉移、美國腫瘤聯合委員會（AJCC）第8版分期、門靜脈侵犯等臨床病理資料。患者年齡38～81歲，中位年齡61歲。通過電話或門診隨訪，隨訪時間為手術之日起至死亡或末次隨訪時間，截止時間2021 年7月30日。

1.2 免疫組織化學分析

將石蠟包埋的組織連續切片，65 ℃烤片過夜，進行二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后于磷酸鹽緩沖液（PBS）中浸洗3次，每次5 min。使用檸檬酸抗原修復液進行抗原修復，PBS沖洗3次。3% H2O2室溫孵育15 min，PBS沖洗3次，滴加山羊血清，室溫孵育15 min，再次PBS沖洗3次。滴加一抗（TPD52兔抗人多克隆抗體，1∶100稀釋），濕盒內4 ℃過夜，次日PBS沖洗3次；加辣根過氧化物酶標記二抗（羊抗兔IgG抗體，1∶500稀釋），37 ℃孵育60 min，PBS沖洗3次。二氨基聯苯胺液顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固。于顯微鏡下觀察。

1.3 免疫組織化學結果判定

由兩名病理科醫師閱片，高倍鏡（×400）下隨機選取5 個不同視野，按陽性細胞所占的百分比計分：≤5%為0 分，＞5%且≤25%為1 分，＞25%且≤50%為2分，＞50%為3分。根據染色強弱程度計分：無染色0 分；出現淡黃色顆粒為1 分；出現淺棕黃色顆粒為2 分；出現大量深棕黃色的顆粒為3 分。最終根據兩者的乘積確定該組織標本的免疫組化評分值：0～3 分為低表達，4～9 分為高表達。將組織標本分為低表達組、高表達組，進行統計學處理。

1.4 統計學分析

應用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析，Graph-Pad Prism 5繪制生存曲線。計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。生存曲線分析采用Kaplan-Meier法，Log-rank測驗比較兩組的不同趨勢。單因素及多因素生存分析采用Cox風險回歸模型。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組織與癌旁組織TPD52的表達

TPD52在胰腺癌及癌旁組織中的表達主要定位于細胞漿及細胞膜中，呈清晰棕色或棕褐色（見圖1）。64.3%（83/129）胰腺癌組織中TPD52高表達，而僅34.9%（45/129）癌旁正常組織中TPD52高表達，兩組間差異有統計學意義（χ2=22.389，P＜0.001）。

圖1 胰腺癌及癌旁組織中TPD52的表達（免疫組織化學，×100）

2.2 TPD52表達與胰腺癌患者臨床病理特征的關系

胰腺癌組織中TPD52 的高表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結轉移、肝轉移及門靜脈侵犯無明顯相關（P＞0.05），但與患者的TNM分期、神經浸潤及組織分化程度明顯相關（P＜0.05）。III～IV期胰腺組織中TPD52高表達的比例顯著高于I～II期（χ2=4.178，P=0.041）。存在神經侵犯組TPD52的高表達率高于無神經侵犯組，其差異有統計學意義（χ2=8.499，P=0.004）。不同分化程度組的TPD52 高表達率差異有統計學意義（χ2=12.262，P=0.002），見表1。

表1 胰腺癌組織TPD52表達與患者臨床病理特征之間的關系（例）

2.3 TPD52表達與胰腺癌患者無病生存時間（disease free survival，DFS）的關系

Kaplan-Merier生存分析顯示，中位無病生存時間（mDFS）為11.8個月，其中TPD52高表達者mDFS為8.3個月，TPD52低表達者mDFS為18.7個月，兩組間差異有統計學意義（Log-rankχ2=11.460，P=0.001），見圖2。多因素Cox比例風險模型顯示，淋巴結轉移（HR1.931，95%CI1.233～3.025，P=0.004）、組織分化程度（HR2.148，95%CI1.144～4.035，P=0.017）、門靜脈侵犯（HR2.026，95%CI1.020～4.025，P=0.044）及TPD52高表達（HR1.696，95%CI1.130～2.545，P=0.011）是影響胰腺癌患者術后DFS的獨立危險因素（見表2）。

表2 Cox回歸分析影響胰腺癌患者術后DFS的因素

圖2 Kaplan-Meier無病生存曲線

2.4 TPD52表達與胰腺癌患者總生存時間（overall survival，OS）的關系

Kaplan-Merier生存分析顯示，中位總生存時間（mOS）為20.9 個月，其中TPD52 高表達者mOS為16.6 個月，TPD52 低表達者mOS為24.6 個月，兩組間差異有統計學意義（Log-rankχ2=11.450，P=0.001，生存曲線見圖3。多因素Cox比例風險模型顯示，淋巴結轉移（HR1.711，95%CI1.099～2.665，P=0.017）、肝轉移（HR2.987，95%CI1.141～7.821，P=0.026）及TPD52高表達（HR1.656，95%CI1.100～2.492，P=0.016）是影響胰腺癌患者術后OS的獨立危險因素（見表3）。

表3 Cox回歸分析影響胰腺癌患者術后OS的因素

圖3 Kaplan-Meier總生存曲線

3 討論

人類腫瘤蛋白D52（human tumor protein D52，hTPD52）是Byrne在研究乳腺癌中首次發現，編碼hTPD52 的基因位于人類染色體8q21.13[4]，其家族成員包括TPD52、TPD52L1、TPD52L2和TPD52L3四種蛋白。TPD52 能夠促進腫瘤的增殖、侵襲與轉移，同時抑制DNA修復和腫瘤細胞凋亡。另外，在TPD52誘導下機體可以產生對腫瘤有保護作用的免疫反應[5]，其產生的自身抗體，可能成為一個潛在的分子治療靶標[6]。

大量研究發現TPD52 在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌以及血液系統惡性腫瘤等疾病中通過基因擴增來提高其表達水平，調控細胞增殖、遷移及侵襲等生物學行為，進而導致惡性腫瘤的發生，并與淋巴結轉移、腫瘤晚期階段等相關[7-11]。我們前期研究中，體外實驗發現抑制TPD52表達可明顯抑制胰腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力，導致細胞周期阻滯，并促進細胞凋亡[12]。本研究從臨床層次出發，通過免疫組化染色顯示，胰腺癌組織中TPD52的表達明顯高于癌旁正常組織。TNM分期晚和存在神經侵犯的胰腺癌患者，TPD52 表達水平高，表明TPD52表達水平與腫瘤進展程度相關。在分化程度較低的病理組織中TPD52的陽性表達率顯著高于分化程度較高的病理組織，提示TPD52表達水平與腫瘤的惡性程度有關。

傳統腫瘤標志物對胰腺癌的診斷缺乏特異性和敏感性，且預后及療效評價指標的缺乏，導致無法選擇最適合的輔助療法延長患者生存時間[13]。因此，尋找新的更加特異胰腺癌預后指標有利于顯著改變胰腺癌預后不良的現狀。根據生存曲線結果，TPD52 表達與胰腺癌患者術后DFS及OS相關，TPD52 高表達患者術后DFS及OS均較短。多因素Cox比例風險模型分析顯示，TPD52 高表達是影響胰腺癌患者術后DFS及OS獨立危險因素。因此，本研究認為TPD52表達與胰腺癌患者的預后存在相關性。TPD52 高表達預示著腫瘤惡性程度高、病情嚴重，預后差；而TPD52 低表達患者的生存時間長，預后較好。

胰腺癌的生物學行為是涉及多步驟、多基因、多信號通路的復雜過程。研究胰腺癌發生、發展過程中的基因改變及其相互關系，進而對關鍵分子加以干預，有希望能夠影響腫瘤的發生、發展，甚至達到治愈腫瘤的目的。Yin等[14]發現microRNA-449b-5p通過靶向TPD52抑制鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲；Zhang等[15]發現敲低TPD52可以顯著減輕microRNA-449過表達對乳腺癌細胞遷移和侵襲以及E-鈣黏著蛋白，N-鈣黏著蛋白和波形蛋白的表達的影響。但TPD52在胰腺癌發生發展中的上下游調控機制尚不清楚，需要進一步研究。

本研究結果證實TPD52在胰腺癌組織中存在高表達，可能是胰腺癌患者預后不良的一個重要預測指標，其在臨床中的其他作用及機制尚待進一步探索。