基于網絡藥理學探討溪黃草治療酒精性肝損傷的作用機制

劉文彬，鐘景斌，王 暉,

（1.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東廣州 510006；2.廣東藥科大學中藥學院，廣東廣州 510006）

隨著經濟的發展，人民生活水平得到了顯著改善，我國酒精類飲料的產量和消耗量隨之迅速增長，我國已成為全球飲酒量上升最快的國家[1]。酒精性肝損傷發病率也呈逐年上升的趨勢，已成為僅次于肝炎病毒感染的第二大肝病[2]。酒精性肝損傷病情初期一般表現為酒精性脂肪肝，隨后逐步發展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化，嚴重酗酒還可能導致廣泛肝細胞壞死甚至肝衰竭[3]。

溪黃草為唇形科植物線紋香茶菜的干燥全草，俗稱熊膽草、血風草、黃汁草等，是廣東民間習用草藥，具有清熱利濕、退黃、涼血散瘀之功能，多用于黃疸性肝炎、急性膽囊炎等疾病[4]。大量研究證實溪黃草具有明確的保肝作用，如許瓊梅等[5]報道溪黃草水提物對CCl4誘導的肝纖維化模型大鼠具有一定的保護作用，其作用機制可能與調節脂質代謝、減輕肝脂質過氧化損傷、抗氧化應激反應、抑制炎癥因子釋放及TGF-β1蛋白表達等有關。葉秋瑩等[6]研究發現溪黃草水提物對小鼠酒精性肝損傷有明顯的保護作用，作用機制與調整抗氧化酶系統有關，但未探討其作用機制。溪黃草主要含有萜類、揮發油類、黃酮類[7]、甾醇類、酚類、香豆素類等多種化學成分[8]。何國林等[9]報道在體外溪黃草總二萜可通過保護肝臟線粒體、調控肝臟內源性抗氧化酶系統等作用發揮保肝功能。鄭玉峰等[10]報道溪黃草黃酮能通過調節 MMP-9、TIMP-1、TGF-β及 PPARγ的表達抑制非酒精性脂肪性肝纖維化的發生、發展。溪黃草同屬植物藍萼香茶菜來源的藍萼甲素通過TGF-β1/Smad信號通路抑制肝星狀細胞的活化，從而發揮治療治療肝纖維化的作用[11]。目前，溪黃草對酒精性肝損傷保護作用的物質基礎和機制尚不明確，限制了其在解酒保肝中的應用。

因此，本研究采用小鼠急性酒精肝損傷模型，觀察溪黃草對小鼠酒精肝損傷的保護效果，并首次采用網絡藥理學方法分析其潛在有效成分和作用機制，并對相關靶點進行了實驗驗證。通過本研究有助于進一步明確溪黃草對急性酒精性肝損傷的保護作用及其可能的作用機制，以期為該產品的進一步開發研究和臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

昆明小鼠 40只 SPF級，雌性，體重18～22 g，10～12周齡，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，實驗單位使用許可編號：SYXK（粵）2017-0125，小鼠飼養溫度20～26 ℃，相對濕度為 50%～60%，每日光照/黑暗時間12 h；溪黃草飲片 湖北金貴中藥飲片有限公司提供，經廣東藥科大學馬鴻雁副教授鑒定為溪黃草（Rabdosia serra）；水飛薊賓 大連美侖生物技術有限公司；紅星二鍋頭酒 北京紅星股份有限公司；蘇木素-伊紅染液 武漢谷歌生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒 美國 Pierce公司；anti-βactin抗體、anti-CYP2E1抗體、anti-Nrf2抗體 武漢博士德生物工程有限公司；生化指標檢測試劑盒均購至于南京建成。

MD SpectraMax M2全波長酶標儀 美國 MD公司；3K15低溫高速離心機 德國SIGMA；Tanon-5200凝膠成像系統 上海天能科技有限公司；超低溫冰箱 中科美菱；JJ-12J脫水機 武漢俊杰電子有限公司；JB-P5包埋機 武漢俊杰電子有限公司；RM2016病理切片機 上海徠卡儀器有限公司；正置光學顯微鏡 日本尼康。

1.2 實驗方法

1.2.1 溪黃草提取液制備 稱取20 g溪黃草，加入100 mL去離子水，浸泡過夜，煎煮2 h，多層紗布過濾去除固體殘渣，合并濾液，旋蒸濃縮，得到溪黃草浸膏，保存于4 ℃冰箱備用，臨用時用純水配置相應濃度溪黃草提取液[5]。

1.2.2 溪黃草提取液對酒精性肝損傷的改善作用

1.2.2.1 動物分組、造模給藥 40只雌性昆明小鼠隨機分為空白組、模型組、溪黃草組、陽性對照組各10只。除空白組外，其余各組按0.1 mL/10 g灌胃52°白酒進行造模，復制酒精性肝損傷模型[12]，連續造模10 d，每次造模1 h后，空白組、模型組給等體積蒸餾水，溪黃草組給藥劑量（相當于4 g溪黃草生藥/kg）、陽性對照組灌胃水飛薊賓（50 mg/kg），共 10 d，造模期間無動物死亡。溪黃草組給藥劑量根據《中藥藥理研究方法學》（第2版）方法折算。

1.2.2.2 肝組織病理觀察 待實驗結束后，取肝臟組織分為兩份，用濾紙吸干血跡，一份固定于4%的多聚甲醛，并包埋于石蠟中，切片厚度4 μm，HE染色后，顯微鏡下觀察肝臟組織的病理變化。另一份迅速投入液氮中，再轉入-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.2.3 生化指標檢測 實驗結束后（最后一次灌胃結束后禁食12 h，自由飲水），小鼠眼球取血，離心分離血清。采用試劑盒法測定谷氨酸脫氫酶（Glutamic acid dehydrogenase，GDH）、谷丙轉氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、還原型谷胱甘肽（Reduced glutathione，GSH）、天冬氨酸氨基轉移酶線粒體同工酶（Mitochondrial aminotransferase，m-AST）、乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase ，GSH-Px）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）。

1.2.2.4 Western blotting檢測Nrf2、CYP2E1蛋白表達 取肝臟組織勻漿，加入裂解混合液，并離心（4 ℃，12000 r/min，15 min）。通過 BCA法測定蛋白濃度。在10% SDS-PAGE凝膠電泳上分離，然后轉移到PVDF膜上，室溫封閉1.5 h，接著在4 ℃下與一抗孵育過夜：次日用TBST洗滌3次后，加入山羊抗兔IgG HRP作為二抗，室溫下孵育2 h，用 TBST洗膜3次，使用ECL化學發光顯色，采用Tanon化學發光成像分析系統顯影，image J軟件分析蛋白條帶、計算灰度值。

1.2.3 溪黃草提取液改善酒精性肝損傷的網絡藥理學研究

1.2.3.1 溪黃草成分收集及靶點預測 利用Cancer HSP（https://tcmspw.com/CancerHSP.php）、BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數據庫檢索溪黃草化學成分信息，結合文獻補充溪黃草成分。再通過PubChem （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 數據庫獲取溪黃草成分的SMILES信息，并將其導入 Swiss ADME（http://www.swissadme.ch/）進行 ADME的篩選，以 GI absorption、Drug likeness為條件，對于未符合數據庫ADME要求的成分，但有相關文獻支撐其藥理活性的成分也納入活性成分中進行靶點預測，通過ADME篩選的成分由Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/） 數據庫獲取潛在靶點信息，同時，將成分的CAS號輸入TCMSP獲取每個成分的OB、DL信息[13]。

1.2.3.2 酒精性肝損傷疾病靶點收集及交集靶點獲取 從 GeneCards（https://www.genecards.org/）、Dig-See（http://210.107.182.61/geneSearch/）數據庫中以“Alcoholic liver injury”為關鍵詞進行檢索，獲取酒精性肝損傷的靶點。將兩數據庫的疾病靶點與成分靶點利用 image GP（http://www.ehbio.com/）獲取交集靶點，并進行韋恩圖可視化[14]。

1.2.3.3 交集靶點PPI網絡構建與可視化分析 將“1.2.3.2”項的交集靶點導入STRING（https://stringdb.org/），選擇“Homo sapiens””類型，運行得到PPI相互作用網絡；設置interaction score為0.4，PPI數據輸出格式為“TSV”，并將其導入Cytoscape3.7.0中進行Network Analysis拓撲分析，并構建PPI網絡可視化，利用插件CytoHubba根據度值（Degree）大小篩選關鍵靶點，最后構建PPI網絡可視化。

1.2.3.4 交集靶點的GO分析與KEGG富集 通過DAVID 6.8 （https://david.ncifcrf.gov/）對交集靶點進行GO富集與KEGG通路富集分析，設置P＜0.05進行篩選，對溪黃草治療酒精性肝損傷的靶點進行生物過程和通路分析，并進行可視化[15]。

1.2.3.5 活性成分-交集靶點-關鍵通路作用網絡構建將1.2.3.1項的活性成分、1.2.3.2項的交集靶點、1.2.3.3項的關鍵通路導入Cytoscape3.7.0中，構建活性成分、靶點、通路的作用關系，在該網絡中，節點（node）分別代表成分、靶點、通路，而相互作用關系以邊（edge）來表示，構建相互作用網絡探究溪黃草治療酒精性肝損傷的多成分，多靶點、多治療途徑的作用機理[16]。

1.3 數據處理

應用SPSS20.0軟件進行統計學分析。數據以平均值±標準差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表明差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 溪黃草對酒精性肝損傷的改善作用

2.1.1 溪黃草對酒精性肝損傷小鼠肝臟病理組織的影響 肝臟HE染色顯示，空白組小鼠肝小葉結構清晰、具有典型輻射狀結構，胞質均勻、紅染，結構完整，細胞界線清晰，肝板排列整齊規則，肝細胞圓潤、飽滿、無變性且呈多邊形；細胞核大小正常，核質分布均勻；模型組肝小葉界限不清，肝細胞索紊亂，肝細胞出現廣泛氣球樣變性，大小不一，胞質空泡化，可見幾處局灶性壞死，并伴有炎性細胞浸潤等病理改變；與模型組相比，陽性給藥組、溪黃草組小鼠肝臟未見氣球樣變，少見匯管區有炎性細胞浸潤，大部分肝細胞接近正常形態，肝臟結構損傷程度明顯減輕，見圖1。

圖1 溪黃草對酒精性肝損傷小鼠肝臟病理組織的影響（HE 染色，200×）Fig.1 Effect of Rabdosia serra on liver histopathology of mice with alcoholic liver injury （HE staining, 200×）

2.1.2 溪黃草對酒精性肝損傷小鼠肝功能的影響AST和ALT是主要的肝臟細胞功能酶[17]，m-AST和GDH為肝細胞線粒體特異酶，均可特異性地反映肝損傷的程度[18]。與空白組相比，模型組小鼠肝臟中ALT、AST、m-AST、GDH蛋白表達水平極顯著上調（P＜0.01），提示酒精性肝損傷造模成功；溪黃草組AST、m-AST、GDH蛋白表達水平顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），提示溪黃草具有較好的保肝作用。水飛薊賓組ALT和AST顯著低于溪黃草組（P＜0.05或P＜0.01），m-AST 和 GDH 兩組無統計學差異，見表1。

表1 溪黃草對酒精性肝損傷小鼠肝功能的影響Table 1 Effect of Rabdosia serra on liver function in mice with alcoholic liver injury

2.1.3 溪黃草對酒精性肝損傷小鼠酒精相關代謝酶和抗氧化指標的影響 在飲酒初期，肝臟主要依靠酒精相關代謝酶ADH、CAT代謝酒精。與空白組相比，模型組小鼠肝臟中ADH和CAT蛋白表達水平極顯著下調（P＜0.01）；溪黃草組ADH和CAT蛋白表達水平顯著高于模型組（P＜0.05或P＜0.01），提示溪黃草對肝臟酒精相關代謝酶的活性具有促進作用。溪黃草組和水飛薊賓組在ADH和CAT無統計學差異。見表2。

表2 溪黃草對酒精性肝損傷小鼠酒精相關代謝酶的影響Table 2 Effect of Rabdosia serraon alcohol related metabolic enzymes in mice with alcoholic liver injury

現代醫學認為當飲酒過量時，將引起機體酒精代謝酶活性、抗氧化性以及脂質氧化等一系列異常反應，進而導致肝臟的功能性損傷[19]。機體內的抗氧化防御體系分為非酶類的抗氧化物質（GSH）和酶類抗氧化物質（SOD、GSH-Px）[20]。SOD和 GSH-Px作為肝臟氧化活性酶，參與酒精代謝過程中產生的ROS的氧化代謝，其值大小能夠反映肝臟的受損情況[21]。MDA為脂質過氧化的終產物，其值能夠間接反映機體組織過氧化的損傷程度。因此，SOD、GSHPx、GSH和MDA是反映肝臟氧化損傷的重要指標[22]。由表3可知，與空白對照組相比，模型組小鼠肝臟中SOD和GSH-Px、GSH蛋白表達水平表達極顯著下調（P＜0.01），MDA蛋白表達水平極顯著上調（P＜0.01）。溪黃草組SOD和GSH-Px、GSH蛋白表達水平顯著高于模型組（P＜0.05 或P＜0.01），MDA 蛋白表達水平顯著低于模型組（P＜0.05）。本研究結果顯示溪黃草對酒精性肝損傷具有較好的抗氧化應激作用，這與何國林等[9]研究溪黃草總二萜調控肝臟內源性抗氧化酶系統等作用發揮保肝功能的結果類似。溪黃草組和水飛薊賓組在SOD、GSH-Px、GSH和MDA無統計學差異。

表3 溪黃草對酒精性肝損傷小鼠抗氧化指標的影響Table 3 Effects of Rabdosia serra on antioxidant indexes in mice with alcoholic liver injury

2.2 溪黃草治療酒精性肝損傷的網絡藥理學研究

中藥具有多靶點和多組分的特點，網絡藥理學通過多向藥理學、蛋白組學、功能基因學、網絡可視化等技術，可用于揭示中藥的多組分與機體的復雜作用[23]，并預測其潛在的作用機制，越來越多的研究者將該方法運用于中藥的藥理學研究[24-25]。

2.2.1 溪黃草成分獲取與靶點收集 經過篩選后，以“溪黃草”為關鍵詞在Cancer HSP、BATMAN-TCM數據庫篩選出符合靶點預測的活性成分5個，同時，由文獻補充12個成分，共收集溪黃草17個活性成分，信息見表4。由Swiss Target Prediction數據庫預測17個成分的靶點，經去重，獲得431個成分靶點。

表4 溪黃草活性成分Table 4 Active components of Rabdosia serra

2.2.2 疾病靶點構建 從GeneCards（紫圈）、DigSee（藍圈）數據庫分別收集到5230、217個相關疾病靶點，將疾病靶點（黑圈）與成分靶點取交集獲得34個溪黃草治療酒精性肝損傷潛在的共同靶點，見圖2。

圖2 共同靶點韋恩圖Fig.2 Wayne diagram of common target

2.2.3 PPI網絡構建 由String數據庫構建的PPI網絡導入Cytoscape3.7.0中，得到33個節點，155條邊的 PPI網絡，平均度值（degree）為7.42，以 degree≥7.42為篩選條件，篩選出18個關鍵靶點，利用Cyto-Hubba根據degree大小顯示不同的顏色，顏色越深表示degree越大，該靶點作用關系越重要。在該網絡中，節點為靶點，邊表示靶點之間的相互作用關系，見圖3。

圖3 PPI網絡構建與關鍵靶點篩選Fig.3 PPI network construction and key target screening

2.2.4 GO生物功能注釋與KEGG富集通路分析結果 對溪黃草治療酒精性肝損傷的34個共同靶點通過DAVID數據庫進行GO功能富集與KEGG通路分析，由GO富集顯示得到生物學功能條目58個（P＜0.05），其中，生物過程（BP）為 44 條，細胞組成（CC）為 4 條，分子功能（MF）為 10 條，見圖4。34 個靶點參與炎癥應答、免疫響應、IL-8和一氧化氮生物合成過程的調控、自噬的負調控、細胞因子分泌的正調控、參與活性氧代謝過程、調控內在凋亡信號通路等發揮關鍵治療作用的生物過程；在分子功能方面，發揮調節絲氨酸型內肽酶活性、血紅素結合、類固醇激素受體活性、過氧化物酶活性、趨化因子受體活性、氧化還原酶活性、脂多糖結合等功能作用，提示溪黃草通過體內的多種生物學過程發揮治療酒精性肝損傷的作用。KEGG通路富集得到（P＜0.05）23條信號通路，提示溪黃草活性主要涉及調控PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎、腫瘤壞死因子信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、細胞凋亡通路、NF-κB信號通路、缺氧誘導因子-1信號通路、Toll樣受體信號通路、非酒精性脂肪性肝病通路、脂肪細胞因子信號通路等關鍵通路發揮抗酒精性肝損傷治療作用，見圖5。

圖4 GO功能注釋分析Fig.4 GO function annotation analysis

圖5 關鍵KEGG通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of key KEGG pathways

2.2.5 活性成分-靶點-關鍵通路作用網絡構建 由溪黃草活性成分、共同靶點、關鍵通路構建相互作用網絡，見圖6。該網絡中包含61個節點，151條邊，紫色倒三角代表活性成分、深紅色橢圓形表示靶點、深綠色方形代表關鍵通路，邊表示成分、靶點、通路三者的作用網絡關系。利用Network Aanlyzer 插件對該網絡進行拓撲數據分析，平均度值（Degree）為4.95，平均介數（Betweenness Centrality）為 0.03，平均中心性（Closeness Centrality）為0.34。根據度值大小，從活性成分角度，咖啡酸、迷迭香酸、槲皮素、胡麻素、異鼠李素是溪黃草中最有可能的活性物質，均具有保肝作用。咖啡酸是一種酚酸，咖啡酸及其衍生物均具有抗氧化和保肝等生物活性，迷迭香酸可通過調節NF-κB信號通路預防DEN誘導的大鼠原發性肝癌，槲皮素[26]可通過加強機體的抗氧化應激水平相關，而且與抑制NF-κB信號通路發揮保肝作用。度值靠前5位的靶點有Nrf2、CYP2E1、PTGS2、MMP9、MMP2 。由該網絡可見，多成分作用不同的靶點，靶點參與不同通路的調控，顯示溪黃草通過在多成分作用于多靶點，參與多通路的調控發揮治療酒精性肝損傷的作用機制。

圖6 溪黃草成分-靶點-關鍵通路網絡Fig.6 Network of Rabdosia serra component-target-key pathways

2.2.6 Western-blot驗證關鍵靶點Nrf2、CYP2E1表達情況 過量飲酒時，可大幅誘導CYP2E1的上調且伴隨ROS的產生，導致機體氧化-抗氧化系統失衡。當酒精誘導CYP2E1水平上升時，Nrf2被激活且水平上調來對抗自身產生的氧化應激[27]，引起機體保護性適應性反應，此外藥物上調Nrf2可進一步對抗酒精引起的氧化損傷發揮保護作用[28]。與空白對照組相比，模型組小鼠肝臟中Nrf2、CYP2E1蛋白表達水平表達極顯著上調（t=7.767，P＜0.01；t=7.199，P＜0.01）；經溪黃草給藥干預后，溪黃草組與模型組相比，Nrf2 蛋白表達極顯著上調（t=5.059，P＜0.01），CYP2E1蛋白表達極顯著下調（t=4.112，P＜0.01），見圖7。本研究結果顯示溪黃草可下調CYP2E1的表達降低氧化氧化應激反應，并上調Nrf2對抗酒精引起的氧化損傷作用。

圖7 溪黃草對關鍵靶點Nrf2、CYP2E1蛋白表達的影響± s，n=3）Fig.7 Effect of Rabdosia serra on the expression of Nrf2 and CYP2E1 protein± s，n=3）

3 結論

溪黃草為廣東習用中藥，尤其是連州產的溪黃草已成為國家地理標志性產品。溪黃草雖保肝作用明確，但其作用機制和物質基礎不詳，限制了其在臨床中的應用。本研究通過建立小鼠酒精性肝損傷模型，考察了溪黃草對酒精性肝損傷的保護作用，創新性的通過網絡藥理學方法對其有效成分和作用靶點進行了推測并進行了驗證。結果顯示，溪黃草可明顯改善酒精導致的肝損傷，提高肝臟內酒精相關代謝酶，通過增強非酶抗氧化和抗氧化酶的活性而提高對ROS的清除能力，降低脂質過氧化物的產生，其分子機制可能與溪黃草抑制CYP2E1水平升高，激活Nrf2的表達，從而降低氧化應激造成的損傷相關。

本研究明確了溪黃草對急性酒精性肝損傷的保肝作用及其可能的作用機制，為該產品的進一步開發研究和臨床應用提供了科學依據。但仍存在諸多不足，如雖對溪黃草抗酒精性肝損傷的物質基礎進行了推測，但未對其加以驗證，在分子機制研究中，只對關鍵靶點進行了驗證，而缺乏對其完整信號通路的調控研究，上述不足也是課題組下一步研究的重點。