海菜花結合酚的組成、抗氧化活性及其對DNA損傷的保護作用

劉 青，張天陽，洪 玥，李媛麗，李 望，高春燕,2，盧躍紅,2,

（1.大理大學公共衛生學院，云南大理 671000；2.北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川 750021）

海菜花（Ottelia acuminata（Gagnep.）Dandy，O.acuminata），又稱異葉水車前、小海帶、龍爪菜等，系水鱉科，水車前屬[1]，沉水植物，生長在池塘和淡水湖泊內，喜溫暖；是云貴高原和中國西南地區特有的水生植物[2-3]，云南為海菜花的主要分布區。海菜花營養豐富且齊全[4]，含多種礦物質元素[5]，全株蛋白質含量24.12%、脂肪含量7.14%、粗纖維含量8.43%[6]，游離酚提取物總酚含量為257.62～388.19 mg/g Extract[7]。在云南，海菜花是一種美味的食用蔬菜；同時也是一味傳統白族中藥，用于治小便不利、便秘、熱咳、咯血、哮喘、淋癥、水腫等多種疾病[8]；另外，海菜花還具有凈化水質的作用[9]。海菜花是一種極具開發潛力的植物資源[10]。

植物多酚是植物中分布最廣的次生代謝產物之一，主要以結合酚和游離酚的形態存在，具有抗氧化活性[11]、抗炎活性[12-13]、抗菌活性[14]、抗腫瘤活性[15]、保護DNA損傷[16]、延緩衰老[17]、調節腸道微生物[18]等作用及功效。近幾年來，植物多酚的組成與功效引起了廣大科研工作者的極大興趣。

目前，海菜花在云南主要作為一種食用蔬菜大面積栽培[19]，對其研究大多集中在其生物學特性[20-24]、生態學保護利用方面[25-26]，而對其營養組成、多酚的組成與功效方面的報道還比較少。本課題組2019年報道了海菜花游離酚提取物的多酚組成及部分功能活性[7]。本研究擬對海菜結合酚的組成、抗氧化活性以及對DNA損傷的保護作用進行研究，為海菜花的合理食用、藥用提供理論依據，對于海菜花的保護、利用、開發以及促進當地經濟發展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海菜花 于2020年10月在云南省大理白族自治州大理市洱源縣鄧川鎮采集，將采集的海菜花分為花、莖、葉三部分，各部分樣品分別進行除雜、清洗、冷凍干燥、粉粹，并密封儲存于4 ℃冰箱備用；福林-酚試劑、標準品（綠原酸、咖啡酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、木犀草素、阿魏酸）、pBR322質粒DNA（0.5 μg/L）、DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）、Trolox 標準品（6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸）、ABTS（2,2’-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽） 美國 Sigma試劑公司；沒食子酸（GaLLic-Acid） 成都市科龍化工試劑廠；乙腈和色譜甲醇美國Fisher公司；乙酸乙酯、濃鹽酸、乙醇等 為國產分析純。

RE-3000旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；水浴震蕩（HZS-HA） 哈爾濱市東明醫療儀器廠；真空冷凍干燥機（Scientz-ND系列） 寧波新芝生物科技有限公司；722N可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；AgiLent 1260高相液相色譜儀（帶紫外檢測器）、色譜柱（ZORAAX SA-C18，5 μm，250 mm×4.6 mm） 美國AgiLent公司；DYY-6C型電泳儀北京市六一儀器廠；G:AOX-F3凝膠成像系統 基因有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 結合酚的提取與純化 參照郭琦等[27]的方法稍作修改，分別稱取花、莖、葉不同部位樣品5 g左右，用80%的甲醇提取3次后，殘渣用含有EDTA和抗壞血酸的NaOH溶液避光水解4 h，水解結束后調pH至1，抽濾，乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相，旋轉蒸發除去乙酸乙酯后得結合酚粗提取液。粗提液用95%乙醇激活的X-5大孔樹脂水浴振蕩吸附24 h（25 ℃，120 r/min）后抽濾，收集大孔樹脂，加入70%乙醇，相同條件下水浴振蕩解析24 h，抽濾，收集濾液，35 ℃旋轉蒸發除去乙醇，真空冷凍干燥，得純化的結合酚提取物，-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 總酚含量測定 參照文獻[28]的方法稍作修改，分別吸取不同體積（80～320 μL）的沒食子酸標準溶液（100 μg/mL）加 100 μL 福林-酚試劑（1 mg/mL），混勻，3 min后，加2 mL 7.5% Na2CO3，純水定容至5 mL，避光反應40 min后，于760 nm波長測吸光度值。得標準曲線方程為A=0.0729C+0.062（R2=0.9916）。分別測定花、莖、葉結合酚提取物吸光度值，代入標曲計算得到樣品中的總酚含量。樣品中的總酚含量以每克海菜花結合酚提取物中沒食子酸相當的質量表示（mg GAE/g Extract）。

1.2.3 總黃酮含量測定 參照烏仁格格[29]的方法稍加修改。分別吸取不同體積（0.5～2.5 mL）的兒茶素標準溶液（100 μg/mL）加甲醇補足至 2.5 mL，加 0.15 mL NaNO3（5%），搖勻靜置 6 min，加 0.15 mL AlCl3（10%），搖勻避光靜置 6 min，加 2 mL NaOH（4%），純水定容至5 mL，靜置15 min后，于510 nm波長測吸光度值。得標準曲線方程為A=7.3829C+0.0161（R2=0.9978）。準確吸取 100 μL海菜花結合酚（10 mg/mL），測定總黃酮含量。樣品中的總黃酮含量以每克海菜花提取物中兒茶素相當的質量表示（mg CAE/g Extract）。

1.2.4 酚類化合物單體分析 采用高效液相色譜（HPLC）對結合酚的組成進行分析。液相色譜條件：流速 0.8 mL/min，柱溫 37 ℃，進樣量 10 μL，波長280 nm；流動相A為100%色譜乙腈，流動相B為1%乙酸超純水溶液（乙酸/H2O，1/100，v/v）。梯度洗脫程序：0～11 min：A由 2%升至 17%，B由 98%降至 83%；11～17 min：A由 17%升至 24%，B由 83%降至76%；17～22 min：A由24%升至26%，B由76%降至 74%；22～28 min：A由 26%升至 28%，B由74%降至 72%；28～33 min：A由 28%降至 18%，B由72%升至82%；33～35 min：A由18%降至10%，B由82%升至90%；35～38 min：A由10%降至2%，B由90%升至98%。以綠原酸、咖啡酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、木犀草素、阿魏酸為標準品，設5個不同的濃度梯度（20.0、40.00、60.00、80.00、100.00 μg/mL），分別進行HPLC分析，確定出峰時間及峰面積值。以標品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標分別繪制標準曲線。樣品用色譜甲醇稀釋成2.0 mg/mL，過0.22 μm微孔濾膜，進樣分析。將峰面積代入標準曲線方程分別計算樣品中各單體酚的含量。

1.2.5 抗氧化活性測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力 參照Tan等[30]的方法，稍加修改。將結合酚提取物用甲醇配制成35 μg/mL的溶液，吸取 0.5 mL與3.5 mL DPPH甲醇溶液（60 μmol/L）混勻，暗室反應 30 min 后，于517 nm波長測吸光值，并計算清除率。

式中：A1為0.5 mL甲醇+3.5 mL DPPH溶液的吸光度值；A2為0.5 mL樣品+3.5 mL甲醇溶液的吸光度值；A3為0.5 mL樣品+3.5 mL DPPH溶液的吸光度值。

以 Trolox（10～100 μmol/L）繪制標準曲線，得回歸方程為：A=0.6172C-4.1529（R2=0.9965），A 為清除率，C為濃度。樣品對DPPH自由基清除能力的結果以毫摩爾Trolox等量每克海菜花結合酚提取物表示（mmol TE/g Extract）。

1.2.5.2 鐵還原抗氧化能力 參照Song等[31]的方法，分別吸取100 μL不同濃度梯度的FeSO4·7H2O（100～1000 μmol/L）標準液加 1.4 mL FRAP 工作液[30 mmol/L TPTZ:0.3 mol/L pH 3.6乙酸鈉緩液:20 mmol/L FeCl3，1:10:1（v:v:v）]和 2 mL 純水，混勻，在37 ℃下水浴30 min，于593 nm波長測吸光值。得回歸方程：A=0.0006C+0.0034（R2=0.9937），A為吸光度值，C為FeSO4·7H2O濃度。將結合酚提取物用甲醇配制成250 μg/mL的溶液進行測定。樣品的FRAP結果以mmol Fe2+每克海菜花結合酚提取物表示（mmoL Fe2+/g Extract）。

1.2.5.3 Trolox等量抗氧化活性 參考張天陽等[32]的方法稍作修改。分別吸取不同濃度梯度的Trolox 25 μL（100～1000 μmol/L），加 2 mL ABTS+·工作液反應6 min后，于734 nm波長測吸光度值，以純甲醇為空白對照，繪制標準曲線，得回歸方程：A=-0.0004C+0.6679（R2=0.9995），A 為吸光度值，C 為Trolox濃度。將海菜花提取物用甲醇配制成1.0 mg/mL的溶液進行測定。測定結果以毫摩爾Trolox等量每克海菜花結合酚提取物表示（mmol TE/g Extract）。

1.2.5.4 羥基自由基清除活性 參照盧躍紅等[33]的方法稍加修改。以Trolox為陽性對照，100 μL不同濃度的結合酚溶液（0.25～4.0 mg/mL）或Trolox溶液（0.5～8.0 μg/mL）與 1.5 mL PBS 緩沖液（10 mmol/L）、150 μL 脫 氧核糖（25 mmol/L） 、150 μL 的 FeCl3（1 mmol/L）、150 μL EDTA（1.04 mmol/L）、150 μL H2O2（15 mmol/L）和 150 μL 抗壞血酸（1 mmol/L），充分混勻，在37 ℃下水浴30 min后，加1 mL三氯乙酸（2.8%）和1 mL硫代巴比妥酸（0.5%），沸水浴15 min，于532 nm波長測定吸光度值。對照管用PBS溶液代替樣品或Trolox。

式中：A樣表示樣品的吸光度值；A對表示對照管的吸光度值。

1.2.5.5 DNA損傷的保護作用 參照林琳等[34]的方法稍加修改。反應體系：1 μL DNA、11 μL PBS 溶液、5 μL海菜花結合酚提取物或VC與3 μL AAPH溶液充分混勻后，37 ℃水浴避光反應45 min。反應結束后，吸取 4 μL 反應液與 2 μL loading buffer（含0.15%溴酚藍、10 mmol/L EDTA 和40%蔗糖）混勻，吸取4 μL混合液置于1.0%瓊脂糖凝膠中，電泳（60 V、50 min）。待電泳結束后，凝膠成像系統進行半定量分析，計算雙螺旋百分比。

式中：A0為雙螺旋構象的灰度值；A1為開環型構象的灰度值；A2為線性構象的灰度值。

1.3 數據處理

所有實驗均重復3次，實驗數據使用Excel和SPSS 19.0進行分析，采用方差分析進行顯著性檢驗，組間差異采用Tukey多重檢驗，P＜0.05認為差異具有統計學意義，結果用均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 總酚和總黃酮含量

海菜花不同部位結合酚提取物的總酚含量和黃酮含量測定結果見表1。由表可知，花、莖、葉的總酚含量依次為 366.35±6.37、259.60±2.60、209.72±3.14 mg GAE/g Extract，總酚含量花＞莖＞葉，三者之間的差異具有統計學意義（P＜0.05）；總黃酮含量依次為466.08±4.05、305.72±7.92、156.69±2.34 mg CAE/g Extract，其花＞莖＞葉，三者之間的差異具有統計學意義（P＜0.05）。本研究中，海菜花不同部位結合酚提取物的總酚含量與黃酮含量總體趨勢一致，即花含量最高，其次為莖，葉最低。本研究測定的海菜花結合酚總酚含量略低于Lu等[7]報道的海菜花游離酚總酚含量（257.62～388.19 mg/g Extract），不同部位游離酚總酚含量與本研究測定的不同部位結合酚含量總體趨勢一致，均是花的高于莖的，莖的高于葉的。這表明海菜花不同部位的結合酚含量有差異。

表1 海菜花結合酚提取物總酚和總黃酮含量Table 1 Total phenolic content and flavonoid content of bound phenolics from O.acuminata extract

2.2 海菜花結合酚組成與含量

綠原酸、咖啡酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、阿魏酸和木犀草素5種標準品的標準曲線方程分別為：y=20.19x+52.38，y=21.07x+58.205，y=5.4105x+17.274，y=34.816x+105，y=21.049x+42.551，R2均大于 0.998，標準品在測定的濃度范圍內呈良好的線性關系。不同部位結合酚的組成及含量見表2。由表2可知，含量最高的是咖啡酸（86.51～102.28 mg/g Extract）；含量第二的是槲皮素-3-O-葡萄糖苷（5.50～28.01 mg/g Extract）；其余三種酚類物質的含量為0.31～3.09 mg/g Extract。同一種酚類物質在不同部位的分布具有顯著差異（P＜0.05）。其中，咖啡酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和阿魏酸均是葉含量最高，其次是花，莖最低；對于綠原酸，莖含量最高，其次是花，葉最低；木犀草素只在花中檢出。本課題組的另一篇文獻報道了海菜花游離酚提取物中主要含有木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、咖啡酰蘋果酸、綠原酸等酚類化合物[8]，部分酚類化合物與本研究鑒定的一致，但在含量上差異較大，這可能是由于同種原料中游離酚和結合酚的種類和含量不同造成的[35]。三個不同部位總單體酚含量范圍為95.22～134.82 mg/g Extract，葉最高，其次為花，莖最低，三者之間的差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 海菜花結合酚提取物的組成及含量Table 2 Composition and content of bound phenolics extracts from O.acuminata

2.3 抗氧化活性

海菜花不同部位結合酚的抗氧化活性見表3。由表3可知，海菜花花、莖、葉的Trolox等量抗氧化活性（TEAC）依次為 1.25±0.06、1.20±0.12、1.19±0.26 μmol TE/g Extract，不同部位之間差異無統計學意義（P＞0.05）；DPPH自由基清除能力依次是0.74±0.13、0.94±0.01、0.84±0.10 mmol/g Extract，三個部位之間無顯著性差異（P＜0.05）；鐵離子還原能力（FRAP）依次為 3.61±0.05、4.39±0.03、4.75±0.35 mmol Fe2+/g Extract，葉和莖的FRAP顯著高于花（P＜0.05）；對羥基自由基（·OH）的清除活性 IC50值分別為0.70、1.26、0.34 mg/mL，抑制作用葉強于花，花強于莖，三者之間的差異具有統計學意義（P＜0.05）。三者的抑制作用弱于陽性對照Trolox（IC50值2.81×10-3mg/mL）。植物多酚的抗氧化活性與酚的含量和酚類物質的種類有關[36]，本研究中，4種不同的抗氧化體系研究表明，葉的抗氧化活性最強，這一結果與上述研究結果“葉中總單體酚含量最高”相一致。

表3 海菜花結合酚提取物的抗氧化活性Table 3 Antioxidant activity of bound phenolics extracts from O.acuminata

2.4 對ROO·介導的DNA損傷的保護作用

海菜花結合酚提取物對ROO·介導的DNA損傷的保護作用見圖1。由圖1（左側）電泳結果可知，第1泳道正常DNA主要以正常的雙螺旋分子為主，第2泳道添加了自由基后，由于受到自由基的攻擊，雙螺旋DNA轉變為開環或線性構象，第3～10泳道，添加了不同濃度的海菜花結合酚或VC溶液后，與第2泳道相比，雙螺旋構象的DNA分子條帶隨結合酚或VC溶液濃度的增加逐漸增多。表明海菜花結合酚或VC對ROO·介導的DNA損傷具有明顯的保護作用。圖1（右側）的半定量分析可知，在濃度12.5～500 μg/mL 范圍內，VC、花、莖、葉結合酚的DNA雙螺旋百分比范圍依次為22.00%～48.25%、22.74%～50.07%、18.25%～53.28%、25.93%～53.60%，且大體上在12.5～100 μg/mL濃度范圍內，隨著濃度的增加，保護作用均逐漸增強，即保護作用呈現濃度劑量依賴關系。當葉、莖、花結合酚濃度分別為200、500、300 μg/mL時，其 DNA雙螺旋百分比分別達到最大（53.60%、53.28%、50.07%），均高于陽性對照VC的最大雙螺旋百分比48.25%。由此可見，對ROO·介導的DNA氧化損傷的保護作用葉＞莖＞花＞VC。葉結合酚對DNA損傷的保護作用最強與本文上述的研究結果“葉的抗氧化活性最強、總單體酚含量最高”一致。植物多酚對DNA損傷的保護作用不但與其酚類物質的含量有關，而且與酚類物質的種類有關[37-38]，葉結合酚較強的DNA損傷保護作用可能與其含有較高的咖啡酸和槲皮素素-3-O-葡萄糖苷含量也有關系。咖啡酸具有3，4-二羥基結構，可通過遞氫的方式清除被氧化DNA所形成的過氧自由基，穩定氧原子上的單電子，易生成穩定的半醌式自由基[39]，使得咖啡酸具有較強的清除過氧自由基的能力。據報道咖啡酸[40]、槲皮素素-3-O-葡萄糖苷[41]能有效抑制過氧自由基引起的DNA氧化損傷。

圖1 海菜花結合酚提取物對DNA損傷的保護作用Fig.1 DNA damage protective effect of bound phenolics extracts from O.acuminata

3 結論

海菜花結合酚酚類化合物含量豐富，主要含咖啡酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、阿魏酸、綠原酸和木犀草素5種。不同部位的酚類化合物含量和組成不同。海菜花結合酚具有較強的抗氧化活性以及對ROO·介導的DNA損傷的保護作用。其中，葉結合酚的抗氧化活性及對DNA損傷的保護作用最強。本研究可為海菜花的保護、開發和利用提供一定的理論依據。