β-葡萄糖苷酶的枯草芽孢桿菌表達、酶學性質分析及其在寶藿苷Ⅰ制備中的應用

裴雯雯，曾 艷 ，劉娟娟，張建剛，王 敏，孫媛霞

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.中國科學院天津工業生物技術研究所工業酶國家工程實驗室，天津 300308）

β-葡萄糖苷酶能夠催化水解糖苷或寡糖中結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖鍵，釋放出糖基配體與葡萄糖，在食品醫藥、能源煉制以及飼料加工等領域具有重要的應用價值[1-3]。然而，目前工業應用的β-葡萄糖苷酶大多數來自植物與真菌，存在酶表達量低、酶活力偏低、熱穩定性差等問題，生產使用成本較高。隨著生物技術發展，基因克隆與異源表達成為獲得高效β-葡萄糖苷酶的有效途徑[4-6]。枯草芽孢桿菌作為安全級菌株，具有非致病性、培養簡單快速、蛋白分泌能力強、產物不易形成包涵體等優點[7-9]，是理想的β-葡萄糖苷酶的生產表達宿主，然而，目前有關β-葡萄糖苷酶枯草芽孢桿菌表達的研究報道并不多見。

2002年，國家衛生部將富含黃酮化合物的淫羊藿列為可用于保健食品的藥食兩用植物[10]。寶藿苷Ⅰ（別名淫羊藿次苷Ⅱ）作為淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 等多種淫羊藿黃酮化合物的主要代謝產物，更易被人體吸收利用，具有抗腫瘤、抗骨質疏松、改善認知功能障礙等藥理活性[11-16]。目前寶藿苷Ⅰ的制備主要通過蝸牛酶、纖維素酶或β-葡萄糖苷酶催化降解淫羊藿黃酮化合物進行[17-24]。催化效率高、酶學性質優異的β-葡萄糖苷酶的獲取，將有助于改進現有的酶催化降解制備寶藿苷Ⅰ工藝，降低寶藿苷Ⅰ的工業生產成本。

雖然Thermotoga petrophila來源的耐熱β-葡萄糖苷酶基因TpBgl3（GenBank: ABQ46916.1）已經成功實現大腸桿菌異源表達[25-26]，并應用于人參皂苷與黃芩苷的生物制備[26-27]，卻尚未有TpBgl3枯草芽孢桿菌表達及其應用于寶藿苷Ⅰ生物制備的相關報道。鑒于耐高溫酶的食品工業應用具有提高底物溶解濃度、降低反應體系粘度、防止反應體系染菌的優勢，本研究利用大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pMA5，在枯草芽孢桿菌WB600中對TpBgl3基因進行異源表達，并對重組表達的β-葡萄糖苷酶的酶學性質及其在酶法轉化制備寶藿苷Ⅰ中的應用進行了測試，以期推動枯草芽孢桿菌表達系統以及β-葡萄糖苷酶TpBgl3在食品工業上的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌coliDH5α、枯草芽孢桿菌BacillussubtilisWB600、大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質粒pMA5、含目的基因的載體pET-21a（+） 本研究室前期保藏；LB培養基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L氯化鈉；SR培養基： 15 g/L蛋白胨，25 g/L酵母粉，3 g/L磷酸氫二鉀；質粒DNA抽提試劑盒、DNA回收試劑盒、卡那霉素 上海生工生物工程股份有限公司；DNA Marker、DNA聚合酶、限制性內切酶、重組酶ExnaseⅡ 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；蛋白胨、酵母粉 Oxoid公司；對硝基苯基β-D-葡萄糖苷（pNPG）、對硝基苯酚（pNP） 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ成都曼思特生物科技有限公司；其他試劑 均為國產分析純。

UV-1800型紫外分光光度計 日本島津公司；SQ-510C立式自動壓力蒸汽滅菌器 重慶雅馬拓科技有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；DHP-9082恒溫振蕩培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；Sorvall Stratos高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Bio-Rad PowerPac Basic電泳儀、T100 PCR儀 美國BIORAD公司；1200Series高效液相色譜 安捷倫科技（中國）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌株的構建 按照表1設計引物從載體pET-21a（+）上擴增含酶切位點的β-葡萄糖苷酶基因TpBgl3（GenBank:ABQ46916.1）目的基因。使用限制性內切酶BamH I和Nde I對質粒pMA5進行雙酶切，純化回收線性化載體。在37 ℃下利用重組酶ExnaseⅡ對回收的線性化載體與目的基因片段進行重組，重組產物通過熱擊法轉化至E.coliDH5α感受態細胞中進行質粒擴增。驗證正確后，將構建成功的質粒轉化到B.subtilisWB600中得重組菌。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

1.2.2 重組菌株的發酵表達 在無菌環境中，將1 mL重組枯草芽孢桿菌B.subtilisWB600種子液接種到裝有30 mL SR培養基（含50 μg/mL卡那霉素）的250 mL錐形瓶中，于 30 ℃、200 r/min培養 54 h。每6 h通過紫外吸收光度法（OD600）、重組酶的酶活力測定與聚丙烯酰胺凝膠電泳分別測定菌體濃度、發酵上清液的酶活力以及目標蛋白含量。

1.2.3 重組酶的酶活力測定 參考Xie等[24]報道的方法，采用醋酸-醋酸鈉緩沖液（50 mmol/L，pH6.0）配制2 mmol/L pNPG底物溶液，取900 μL pNPG底物溶液，加入100 μL適當稀釋的酶液在85 ℃、600 r/min下反應10 min，迅速加入1 mL的0.5 mol/L Na2CO3，混合均勻終止反應，測定反應體系在410 nm的吸光值。酶活力單位定義為反應條件下，每分鐘水解pNPG釋放1 μmol pNP所需的酶量。

1.2.4 重組酶的酶學性質

1.2.4.1 最適反應溫度 在 50、60、65、70、75、80、85、90與95 ℃下測定酶活力。以最高酶活力為100%，計算其他溫度下的相對酶活力。

1.2.4.2 溫度穩定性 重組酶溶液在65、75與85 ℃下溫育3 h，每隔30 min取樣，測定殘留酶活力。

1.2.4.3 最適pH 使用50 mol/L的pH3.0甘氨酸-鹽酸緩沖液、pH3.5～6.0醋酸-醋酸鈉緩沖液、pH6.5～8.0磷酸鹽緩沖溶液配制pNPG底物溶液。按照1.2.3方法，測定重組酶在 pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5與7.0下的酶活力，以最高酶活力為100%，計算其他pH下的相對酶活力。

1.2.4.4 pH穩定性[28]選用1.2.4.3中配制的pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5與 7.0緩沖液配制重組酶溶液，在65 ℃下溫育1 h后取樣，測定殘留酶活力。

1.2.4.5 金屬離子對酶活的影響 在反應體系中添加終濃度為 5 mmoL/L 金屬離子（K+、Mg2+、Ni2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+和 Fe3+），測定酶活力。以未添加金屬離子的酶活力為100%，計算金屬離子存在下的相對酶活力。

1.2.5 寶藿苷I的酶解制備工藝

1.2.5.1 酶用量考察 10 mg 淫羊藿苷與1 mL緩沖液 （50 mmol/L、pH4.0）混合后，分別加入 0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6與 2.0 U 的重組β-葡萄糖苷酶，于65 ℃反應1 h后，加入9 mL甲醇終止反應。按照1.2.6方法測定重組酶水解淫羊藿苷生成寶藿苷 I的轉化率，確定酶適宜用量。

1.2.5.2 酶解時間考察 10 mg 淫羊藿苷與1 mL緩沖液 （50 mmol/L、pH4.0）混合后，在酶解溫度 65 ℃、加酶量 0.16 U/mg下，分別反應 0、1、5、10、20、30、40與60 min，測定重組酶水解淫羊藿苷生成寶藿苷I的轉化率，確定最適酶解時間。

1.2.5.3 酶解pH考察 10 mg 淫羊藿苷分別與1 mL、50 mmol/L的 pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的緩沖液混合后，在酶解溫度65 ℃、加酶量0.16 U/mg下反應20 min，測定重組酶水解淫羊藿苷生成寶藿苷I的轉化率，確定最適酶解pH。

1.2.5.4 酶解溫度考察 10 mg淫羊藿苷與1 mL緩沖液（50 mmol/L、pH4.0）混合后，在加酶量0.16 U/mg下，分別于 55、60、65、70、75、80 ℃ 下反應 20 min，測定重組酶水解淫羊藿苷生成寶藿苷I的轉化率，確定最適酶解溫度。

1.2.6 寶藿苷I轉化率的測定 參考于雪娥等[29]報道的方法，使用高效液相色譜測定淫羊藿苷與寶藿苷I含量，計算寶藿苷I轉化率。

色譜條件：Ultimate C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；洗脫溶劑：流動相 A（乙腈+0.1% 甲酸），流動相 B（水+0.1% 甲酸）；梯度洗脫條件為：0～10 min，30% 流動相 A；10～30 min，30%～100% 流動相 A；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

標準曲線繪制：精密稱取淫羊藿苷與寶藿苷I，分別加入無水甲醇進行溶解稀釋，配制質量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8與 1.0 mg/mL的對照樣品。精密吸取各對照溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），對照品溶液質量濃度（μg/mL）為橫坐標（X），繪制淫羊藿苷與寶藿苷Ⅰ的標準曲線，得到線性回歸方程分別為Y=44005X+170.38（R2=0.9984） 與 Y=55060X+309.61（R2=0.9993）。

寶藿苷I轉化率為淫羊藿苷轉化后實際得到寶藿苷Ⅰ與理論上得到寶藿苷Ⅰ的質量比。計算公式如下：

其中，C為根據標準曲線所計算的反應液所含寶藿苷Ⅰ質量濃度（mg/mL）；V為反應液體積（mL）；m為反應液中的底物淫羊藿苷質量（mg）；514.52為寶藿苷Ⅰ的相對分子質量；676.66為淫羊藿苷的相對分子質量。

1.3 數據處理

每組數據重復三次，數據為平均值±標準偏差，使用Excel 2013進行數據圖表處理與統計分析。

2 結果與分析

2.1 重組菌株的構建與發酵表達

將β-葡萄糖苷酶TpBgl3的基因片段與pMA5線性化質粒進行重組連接，產物轉化至E.coliDH5α感受態細胞中。重組表達載體經菌落PCR驗證，結果如圖1所示。重組質粒成功插入了大小約為2200 bp的基因片段，與β-葡萄糖苷酶TpBgl3理論基因長度一致，進一步將重組質粒送至蘇州金唯智有限公司進行測序，測序結果確認重組質粒pMA5-TpBgl3構建成功且無核苷酸突變。

圖1 重組質粒的酶切驗證Fig.1 Enzyme digestion of recombinant plasmid

將重組質粒轉入枯草芽孢桿菌WB600，在30 ℃下進行搖瓶發酵，定時取樣測定OD600與酶活力，結果如圖2所示。重組菌株培養12 h后生長速度加快進入對數期并在培養36 h時達到生長最高峰，之后進入衰亡期。在培養48 h時發酵液酶活力達到峰值，為 69.68 U/mL。Xie等[26]通過 pET-20b /DE3系統大腸桿菌異源表達β-葡萄糖苷酶TpBgl3，發現使用終濃度0.5 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷30 ℃誘導8 h后，發酵液的酶活力達到峰值，為21 U/mL。與之對比，本研究中的枯草芽胞桿菌重組表達β-葡萄糖苷酶TpBgl3，不僅生產安全性提高，產酶水平也有顯著提升。此外，圖3的SDS-PAGE檢測結果顯示，培養24 h后重組枯草芽孢桿菌的發酵上清液在81 kDa附近開始出現蛋白條帶，與預期β-葡萄糖苷酶TpBgl3的分子量大小一致，隨著培養時間延長，目標蛋白條帶明顯變粗變濃，也說明TpBgl3在枯草芽孢桿菌成功實現高效分泌表達。

圖2 重組菌株的生長曲線與產酶曲線Fig.2 Growth curve and enzyme production curve of the recombinant strain

圖3 枯草芽孢桿菌表達的重組蛋白 SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE of the recombinant protein in B.subtilis

2.2 重組β-葡萄糖苷酶酶學性質分析

如圖4a所示，枯草芽孢桿菌表達的TpBgl3最適溫度為85 ℃。75～95 ℃范圍內TpBgl3酶活力保持在最高值的70%以上。65 ℃下的酶活力為最高值的43.79%。由此可見，TpBgl3可以在較廣的溫度范圍發揮催化活性。Cota等[25]通過pET-28a /DE3系統大腸桿菌表達的TpBgl3最適溫度高于80 ℃，Xie等[26]通過pET-20b /DE3系統大腸桿菌表達的TpBgl3最適溫度為90 ℃，盡管不同宿主重組表達的TpBgl3最適溫度有所差異，卻均表明TpBgl3具有較高的最適溫度。

研究發現枯草芽孢桿菌表達的TpBgl3在pH4.0、85 ℃下孵育10 min迅速失活，在 pH6.0、85 ℃與pH4.0、65 ℃下孵育3 h，卻能分別保持54%和87%的相對酶活（圖4b）。與此類似，Cota等[25]報道pET-28a /DE3系統大腸桿菌表達TpBgl3在pH 6.0和pH 4.0下99 ℃半衰期分別為462 min與5 min。Xie等[26]報道pET-20b/DE3大腸桿菌系統表達的TpBgl3在pH7.0、90 ℃下孵育3 h，能保持50%以上的相對酶活。說明TpBgl3的熱穩定性與環境pH相關，酸性極端高溫環境中容易失活，在弱酸性或中性條件下熱穩定性良好。

如圖4c所示，枯草芽孢桿菌重組表達的TpBgl3最適pH為4.0。而通過pET-28a/DE3系統與pET-20b /DE3系統大腸桿菌表達的TpBgl3最適pH分別為4.0與5.0[25-26]。與最適溫度測試結果相似，雖然不同宿主重組表達的TpBgl3最適pH存在差異，卻都顯示出最適反應pH偏酸性。

考慮到TpBgl3在極端高溫的酸性條件下容易失活，選擇在高溫65 ℃下考察TpBgl3的pH穩定性，結果顯示 TpBgl3在 65 ℃、pH3.5～7.0孵育 1 h仍能保持80%以上的相對酶活力（圖4d），說明TpBgl3在65 ℃具有較好的酸堿環境適應性。

圖4 重組表達TpBgl3酶學性質分析Fig.4 Enzymatic characterization of recombinant TpBgl3

金屬離子 Mn2+、Ca2+、Zn2+、Ba2+、Co2+、Mg2+可以激活枯草芽孢桿菌表達TpBgl3的活性，而Cu2+、Fe2+和 Fe3+對酶活力具有抑制作用（表2），這與pET-20b /DE3系統大腸桿菌表達的TpBgl3酶學性質研究報道一致[26]。推測抑制酶活力的金屬離子可能與酶活性部位的氨基酸殘基結合，引起酶構象的改變，阻礙了酶與底物結合[28,30]。

表2 金屬陽離子對重組酶TpBgl3活性的影響Table 2 Effects of metal cations on the activity of recombinant TpBgl3

2.3 重組β-葡萄糖苷酶催化制備寶藿苷Ⅰ研究

根據2.2測試的重組酶酶學性質，選擇10 mg/mL的淫羊藿苷作為底物，設定反應體系pH為枯草芽孢桿菌重組表達TpBgl3的最適反應pH4.0，反應溫度65 ℃，酶解時間1 h，考察酶用量對重組酶催化淫羊藿苷水解制備寶藿苷Ⅰ產率的影響，結果如圖5a所示。隨著酶用量的增加，酶與底物接觸的幾率增大，促進淫羊藿苷水解速度加快，寶藿苷Ⅰ的產率隨之增加，當酶用量為0.12 U/mg時，寶藿苷Ⅰ產率的增加趨于平穩，當酶用量為0.16 U/mg時，酶與底物結合飽和，寶藿苷Ⅰ產率達到平衡。

酶解時間對寶藿苷Ⅰ產率的影響如圖5b所示。在溫度65℃、體系pH 4.0、酶用量0.16 U/mg下，酶解時間0～20 min范圍內，寶藿苷Ⅰ的產率隨著時間延長快速增加，酶解20 min時淫羊藿苷水解生成寶藿苷Ⅰ的轉化率為98.67%，達到平衡，延長酶解時間寶藿苷Ⅰ產率呈現穩定的趨勢。

考慮到淫羊藿苷的水溶解性差，其酶催化下的水解反應體系為懸濁液，與β-葡萄糖苷酶的酶活力測試水溶液反應體系有區別，而溫度與pH是影響β-葡萄糖苷酶水解糖苷制備苷元的重要反應因素[27,31-33]，對淫羊藿苷酶水解催化反應的溫度與pH影響也進行了考察。結果如圖5c與圖5d所示，在酶用量0.16 U/mg、酶解時間20 min下，重組表達β-葡萄糖苷酶TpBgl3催化淫羊藿苷水解最適pH依舊為4.0，寶藿苷Ⅰ的轉化率在65～80 ℃范圍內無明顯差異。

圖5 重組表達TpBgl3催化制備寶藿苷Ⅰ條件優化Fig.5 Optimal conditions of preparing icariside II catalyzed by recombinant TpBgl3

已報道的酶催化淫羊藿苷水解制備寶藿苷Ⅰ工藝中（見表3），常見底物濃度不超過 10 mg/mL，pH維持在 4.0～5.5，酶解溫度 40～50 ℃，酶解時間不少于1 h[17-24]。如Cheng等[21]使用Trichoderma viride來源的β-葡萄糖苷酶催化淫羊藿苷水解，在底物濃度1.0 mg/mL、pH4.0、溫度41 ℃、用酶量9.8 U/mg優化條件下，水解淫羊藿苷1 h的寶藿苷Ⅰ轉化率為95.03%。嗜熱菌Ignisphaera aggregans來源、大腸桿菌重組表達的β-葡萄糖苷酶IagBgl1在底物濃度10 mg/mL、pH6.5、溫度90 ℃、用酶量0.08 U/mg的優化反應條件下，水解淫羊藿苷20 min的寶藿苷Ⅰ轉化率低于50%[24]。本研究表達的β-葡萄糖苷酶在底物濃度10 mg/mL、pH4.0、溫度65 ℃下催化淫羊藿苷水解20 min，酶用量0.08 U/mg與0.16 U/mg下的寶藿苷Ⅰ轉化率分別為65.24與98.67%。對比可見，枯草芽孢桿菌重組表達β-葡萄糖苷酶TpBgl3用于催化淫羊藿苷水解制備寶藿苷Ⅰ，具有酶用量小、用時短、轉化效率高的特點。

表3 酶催化淫羊藿苷水解制備寶藿苷Ⅰ工藝參數對比Table 3 Comparison of technological parameters for preparing icariside II by enzymatic hydrolysis of icariin

3 結論

本研究在枯草芽孢桿菌WB600中成功實現了Thermotoga petrophila來源的β-葡萄糖苷酶TpBgl3的高效分泌表達，獲得的TpBgl3具有較高的最適反應溫度，在65 ℃下溫度耐受性與酸耐受性良好，其應用于淫羊藿苷生物催化降解制備寶藿苷Ⅰ具有酶用量小、用時少、轉化效率高的優勢。這一研究有望為拓展枯草芽孢桿菌表達系統與β-葡萄糖苷酶的食品工業應用提供新思路。鑒于枯草芽孢桿菌表達系統安全性高、酶表達量高的優點，后期可以通過酶發酵條件優化、酶固定化、酶解工藝正交優化以及底物譜篩選等實驗進一步提升枯草芽孢桿菌異源表達β-葡萄糖苷酶TpBgl3在寶藿苷Ⅰ以及其他珍貴苷元化合物生物制備上的應用潛力。