枸杞黃酮提取方法的優化以及不同生態因子與枸杞黃酮相關性研究

王鵬波，謝曉蓉 ，代云云，劉建書，陳 梅，張 霞，裴 棟, ，邸多隆

（1.甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅蘭州 730000；2.中國科學院蘭州化學物理研究所，中國科學院西北特色植物資源化學重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室，甘肅蘭州 730000；3.陜西功能食品工程中心有限公司，陜西西安 710000）

枸杞（Lycium barbarumL.）是茄科植物寧夏枸杞的干燥成熟果實，具有補肝腎，益精血，明目的功效[1]。枸杞的主要化學成分有黃酮類、多糖類、氨基酸、維生素、生物堿類和礦物元素等[2-4]。現代研究表明，枸杞黃酮是其發揮抗氧化、抗衰老、治療心腦血管疾病等藥理活性的主要物質基礎[5-8]。因此，從枸杞中高效提取枸杞黃酮并應用于食品和藥品領域具有重要意義。目前常見的提取枸杞黃酮的方法有溶劑浸提法、回流提取法、超聲提取法、微波輔助法[9-11]等。傳統的溶劑浸提法和回流提取法成本低，適用于工業化大生產，但提取效率低，提取物雜質多[12]；微波輔助法、超聲法省時、提取率高，已廣泛應用于醫藥工業中，但選擇性差，含量低[13]。

高速剪切技術（High-speed Shear Dispersing Emulsifier，HSDE）（又稱閃提法）作為近年發展起來的一種均質化技術，可高效、快速、低能耗地從生物質樣品中提高有效成分，已被應用到藥物研究相關的諸多領域[14-15]。低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvents，DESs）是一種新型的綠色溶劑，在提取分離天然產物中逐漸得到重視[16-17]。與傳統有機溶劑提取方法相比，新型綠色的低共熔溶劑具有低污染、提取率高和可回收利用等優點，近年來，已廣泛應用于黃酮類物質的提取[18-20]，并且明顯提高了黃酮類活性物質的提取量。

本研究首次將高速剪切提取技術和DESs提取方法進行組合用于枸杞黃酮的提取，分別比較了回流提取法、高速剪切輔助乙醇提取法、超聲輔助DESs提取法對枸杞總黃酮提取量的影響，并對高速剪切輔助DESs的提取條件進行優化，篩選出對枸杞黃酮的最佳提取條件。本研究結果對于枸杞黃酮和中藥中黃酮類化合物的提取提供了新方法，并在此基礎上采用SIMCA 14.1軟件分析不同產區生態因子和枸杞黃酮的相關性，為枸杞資源的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞樣品 來源于內蒙古包頭，經甘肅中醫藥大學謝曉蓉教授鑒定為茄科植物寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）的干燥成熟果實，粉碎過50目篩，避光、保存備用；蘆丁對照品 純度≧98%，批號1000800-171130，濟寧天之藍生物科技有限公司；氯化膽堿分析純，安耐吉化學試劑公司；乙二醇 分析純，利安隆博華（天津）醫藥化學有限公司。

XQ100克型多功能高速粉碎機 上海廣沙工貿有限公司；T25高速剪切機 IKA公司；BSA224SCW型電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；KQ-250DB型數控超聲清洗機 昆山超聲儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱上海精宏實驗設備有限公司；H1650型醫用離心機長沙湘儀儀器有限公司；TI-19系列雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取方法的初步篩選

1.2.1.1 乙醇回流法 參照文獻[21]中最佳的提取方法進行實驗測定，具體操作如下：精密稱取枸杞樣品約3.0 g，以70%乙醇、料液比為1:15 g/mL回流提取2次，每次1.5 h，放至室溫，過濾，合并濾液，轉移至100.0 mL容量瓶中，以同濃度乙醇定容，搖勻。在15000 r/min離心機中離心20 min，取上清液即得總黃酮提取液I。

1.2.1.2 高速剪切輔助乙醇提取法 參照文獻[22]中最佳的提取方法進行實驗測定，具體操作如下：精密稱取枸杞樣品約3.0 g，以70%乙醇、料液比為1:20 g/mL，室溫下在高速剪切機18000 r/min條件下處理5 min后，過濾，濾液轉移至100.0 mL容量瓶中，以同濃度乙醇定容，搖勻在15000 r/min離心機中離心20 min，取上清液即得總黃酮提取液II。

1.2.1.3 超聲輔助DES提取法 參照文獻[23]中最佳的提取方法進行實驗測定，具體操作如下：精密稱取枸杞樣品約3.0 g，以DESs（氯化膽堿:乙二醇，摩爾比1:2）、料液比為1:20 g/mL，室溫下在超聲清洗器（功率100 W）處理30 min后，過濾，濾液轉移至100 mL容量瓶中，以同濃度乙醇定容，搖勻在15000 r/min離心機中離心20 min，取上清液即得總黃酮提取液III。

1.2.1.4 高速剪切輔助DES提取法 參考本課題組之前相關研究[24]，精密稱取枸杞樣品約3.0 g，以DESs（氯化膽堿:乙二醇，摩爾比 1:2）、料液比為1:20 g/mL，室溫下在高速剪切機10000 r/min條件下處理5 min后，過濾，濾液轉移至100.0 mL容量瓶中，以同濃度乙醇定容，搖勻在15000 r/min離心機中離心20 min，取上清液即得總黃酮提取液IV。

1.2.1.5 枸杞黃酮含量測定方法 參照文獻[25]進行測定，具體操作如下：精密吸取上述制備的不同提取方法所得樣品溶液1.0 mL，置于10.0 mL容量瓶，各加0.5 mL 5% NaNO2水溶液，搖勻靜置6 min；再各加入 0.5 mL 10% Al（NO3）3水溶液，搖勻靜置6 min；繼續加入4.0 mL 4% NaOH水溶液，用70%乙醇定容，搖勻后靜置15 min。精密吸取水2.0 mL，同法制備以不加蘆丁對照品的空白溶液為參比溶液。分別取參比溶液、樣品溶液，于紫外可見光分光光度計上在吸收波長510 nm處測定。

根據線性回歸方程計算，求出吸取樣品溶液中的總黃酮含量。枸杞中總黃酮的含量按下式計算：

本研究通過前瞻性隊列研究，在 435例乙型肝炎病毒感染患者中進一步探討和驗證了 2型糖尿病與乙型肝炎病毒相關肝癌發病的關系，并提供了 2型糖尿病與乙型肝炎病毒相關肝癌發病風險的前瞻性研究證據。但本研究也存在一定的局限性，如沒有考慮糖尿病病程、糖尿病用藥、抗病毒治療等因素對研究結果的影響，因此尚需納入相關因素進一步開展更大樣本量的研究。總之，在本隊列人群中，2型糖尿病和乙型肝炎病毒相關肝癌發病有關，2型糖尿病增加了乙型肝炎病毒感染患者的肝癌發病風險。

式中：w為黃酮類化合物的含量，mg/g；c為樣品液所測吸光值對應的標準曲線上的濃度，mg/mL；V1為供試品溶液的體積，mL；V2為定容后待測樣品液體積，mL；V3為測吸光值時吸取的供試品溶液的體積，mL；m 為枸杞質量，g。

按照文獻[26]，以蘆丁為對照品，采用UV法在510 nm處測定吸光度。得到蘆丁濃度（c）-吸光度（A）標準曲線，回歸方程、相關系數和線性范圍分別為：A=11.981C+0.0037，R2=0.9995，線性范圍：0.01～0.06 mg/mL之間良好。

1.2.2 高速剪切輔助DES提取參數的單因素考察根據對四種不同方法提取枸杞黃酮的考察結果，優選出高速剪切輔助DESs提取為最佳提取方法。在此基礎上，分別考察料液比（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL），高速剪切轉速（8000、10000、12000、14000、16000 r/min），提取時間為（1、3、5、7、9 min）對黃酮提取量的影響，料液比、轉速和提取時間三個因素的固定水平分別為1:25 g/mL、12000 r/min、5 min，在對各因素進行單因素實驗探究時，其他因素均取固定水平。

1.2.3 正交試驗設計 以枸杞黃酮提取量為考察指標，高速剪切的轉速為（A）、料液比（B）、提取時間（C）為影響因素，并通過三因素三水平L9（34）正交試驗優化提取工藝，因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Orthogonal test factor level design

1.2.4 不同產區生態因子與枸杞黃酮含量的相關性分析 枸杞樣品于2017年9月分別采自15個具有代表性的地區（上述樣品均為寧杞7號），產地生態信息來自國家氣象信息中心（表2）。

表2 枸杞產地生態因子信息Table 2 Information on ecological factors of wolfberry production area

1.3 數據處理

上述實驗過程每組重復三次，采用Microsoft Excel 2017、Origin9.0軟件進行實驗數據處理、分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 四種不同方法提取枸杞黃酮

表3可知四種提取方法中，高速剪切輔助DESs提取效果最佳，乙醇回流提取效果次之，其它2種提取方法效果較差。高速剪切輔助DESs提取法與乙醇回流提取法相比較，后者所用的溶劑體積、提取次數和提取時間遠遠大于前者。僅僅從黃酮提取量評價，乙醇回流提取法比高速剪切輔助乙醇提取法和超聲輔助DESs提取法效率要高，但高速剪切輔助乙醇提取法和超聲輔助DESs提取法所用的溶劑體積、提取次數和提取時間要遠遠少于前者，尚不能簡單地做出結論。高速剪切輔助乙醇提取法和超聲輔助DESs提取法的提取率相當，但后者所用時間要多于前者，是因為超聲提取沒有高速剪切強有力的破除植物細胞纖維促進活性物質流出的效果。高速剪切輔助DESs提取法和高速剪切輔助乙醇提取法相比，前者提取率顯著高于后者是因為DESs中的氫鍵受體易于黃酮類物質的酚羥基結合，并且黃酮類化合物含有大量的酚羥基顯酸性，而DESs中氯化膽堿呈堿性，結合上述兩種原因，可明顯增加枸杞黃酮的提取量。所以高速剪切輔助DESs結合了兩者的優勢，極大的增加了枸杞黃酮的提取量。因此，本研究選擇高速剪切輔助DESs提取枸杞黃酮。

表3 四種提取方法提取枸杞黃酮效果的比較（n=5）Table 3 Comparison of the effect of four extraction methods on extracting flavonoids from Lycium barbarum (n=5)

2.2 單因素實驗結果

圖1 料液比對枸杞黃酮提取量的影響（n=3）Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the extraction volume of Lycium barbarum flavonoids （n=3）

2.2.2 轉速比對枸杞黃酮提取量的影響 由圖2可知，在高速剪切轉速8000～12000 r/min時，黃酮提取量逐漸增大，當12000 r/min達到最大值，隨著轉速的增加，黃酮提取量開始略微下降后保持幾乎不變。在適當的轉速范圍內，較大的轉速可以剪碎植物細胞壁使黃酮類化合物流出，從而增大提取量，若轉速大于12000 r/min后，可能導致除過黃酮以外多種雜質剪切流出，影響黃酮類化合物的釋放與檢測。因此選擇10000、12000、14000 r/min進行后續的正交試驗。

圖2 轉速對枸杞黃酮提取量的影響（n=3）Fig.2 Effect of rotating speed on the extraction volume of Lycium barbarum flavonoids （n=3）

2.2.3 提取時間對枸杞黃酮提取量的影響 由圖3可知，在提取時間1～7 min時，黃酮提取量逐漸增加，7 min時黃酮提取量達到最大值，隨著提取時間的增加，黃酮提取量幾乎保持不變，可能是在7 min的時候將植物組織中的黃酮類物質全部溶出，達到最大值。因此選擇5、7、9 min進行后續的正交試驗。

圖3 提取時間對枸杞黃酮提取量的影響（n=3）Fig.3 Effect of extraction time time on the extraction volume of Lycium barbarum flavonoids （n=3）

2.3 正交試驗

2.3.1 正交試驗設計及結果 以枸杞黃酮提取量為考察指標，高速剪切的轉速為（A）、料液比（B）、提取時間（C）為影響因素，正交試驗設計及結果見表4。

表4 正交試驗結果Table 4 Results of orthogonal test

2.3.2 方差分析結果 由表4～表5可知，各因素影響程度依次為A（轉速）＞C（提取時間）＞B（料液比）。其中因素 A 為 K1＜K2＜K3，因素 B 為 K1＜K3＜K2，因素C為K1＜K2＜K3；因素A的影響程度最大且有顯著差異（P＜0.05），因素 B、C影響程度較小，無顯著性差異（P＞0.05），綜合上述條件，考慮到效率問題，最終確定最優工藝為A3B1C1，即在料液比1:20 g/mL，高速剪切的轉速14000 r/min的情況下提取5 min。

表5 方差分析結果Table 5 Analysis of variance

2.3.3 驗證實驗 為了進一步驗證上述優化工藝條件，先按照正交最佳實驗條件A3B1C1，即在料液比1:20 g/mL，高速剪切的轉速14000 r/min的情況下提取5 min，實驗進行兩組，每組平行重復3次試驗，按照“1.2.1.5”項中來制備和測定出枸杞黃酮提取量。平均結果見表6。

表6 驗證試驗結果（n=3）Table 6 Verification test results (n=3)

實驗結果表明，在上述驗證實驗中，進行了兩組，每組平行3次，枸杞黃酮平均得率為7.11，RSD值＜5%，表明正交試驗優化的提取條件穩定可行。此工藝可用來提取枸杞黃酮。

2.4 不同產區生態因子對枸杞黃酮含量的相關性分析

利用1.2.1.5的方法測得15個產地枸杞樣品黃酮提取量，見表7。

表7 不同產地枸杞總黃酮提取量Table 7 Extraction volume of total flavonoids of Lycium barbarum from different producing areas

通過SIMCA 14.1軟件，利用偏最小二乘回歸（PLS）法分析寧夏枸杞13個產區（韓國樣品a、樣品b采集地不詳，故不做樣品分析）11個生態因子與枸杞黃酮相關性。篩選影響枸杞黃酮含量的生態因子。

用PLS法分析，生態因子與不同產地的枸杞黃酮含量的相關性由變量投影重要性指標（VIP）和正負回歸系數（CoeffCS）決定，其中VIP值越大，說明生態因子對枸杞黃酮含量的影響越大，圖4A中VIP值的貢獻值可以看出，年積溫和無霜期是枸杞黃酮形成、代謝、轉化過程最主要的影響因素。CoeffCS＞0時，生態因子與枸杞黃酮含量成正相關；CoeffCS＜0時，生態因子與枸杞黃酮含量成負相關。CoeffCS的絕對值越大，相關性越大，由圖4B可以看出枸杞黃酮含量與年積溫和無霜期正回歸系數值最大，與海拔的負回歸系數絕對值最大。

圖4 枸杞黃酮含量與生態因子的相關性分析Fig.4 Correlation analysis of Lycium barbarum flavonoids content and ecological factors

3 結論

本實驗考察利用常規方法亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法和紫外-可見分光光度法測定枸杞總黃酮，實驗結果表明在該條件下枸杞總黃酮的專屬性強，測定方法簡便、準確、且重復性好，可作為枸杞中總黃酮的測定方法，并且確定了以高速剪切技術輔助DESs提取枸杞黃酮為最佳的提取方法，實驗通過單因素初步篩選影響因素，在此基礎上采用正交試驗進一步優化枸杞黃酮提取工藝，確定最佳提取工藝為料液比1:20 g/mL，轉速為14000 r/min，提取5 min，此條件經驗證試驗表明，該提取工藝穩定、合理、可行。

本研究系統考察了主要生態因素對枸杞含量的影響，結果表明枸杞黃酮最主要的影響因素是年積溫，枸杞黃酮含量與年積溫和無霜期正回歸系數值最大，與海拔的負回歸系數絕對值最大，并且首次應用PLS法分析了生態因子對枸杞黃酮得率的綜合影響，揭示了溫度、海拔等因素對枸杞活性成分重要作用。對進一步研究枸杞發育過程中活性物質的代謝、合成和變化規律具有一定的借鑒意義。