超高效液相色譜-串聯質譜法測定藻類保健食品中節球藻毒素

李 碩，李 莉

（1.中國計量科學研究院，北京 100029；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

節球藻毒素（Nodularin，NOD）是由泡沫節球藻（Nodularia spumigena）產生的具有強烈肝毒性的藍藻毒素，具有強烈的基因毒性、胚胎毒性和遺傳毒性，長期接觸會增加癌癥患病的風險[1-6]。節球藻毒素為環狀五肽，分子結構式見圖1。國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）公布的致癌物分級清單將節球藻毒素列為3類致癌物[7]。

圖1 節球藻毒素的結構式Fig.1 Molecular structure of nodularin

近年來，以螺旋藻為代表的藻類保健食品，因富含蛋白質、氨基酸、多糖、膳食纖維、不飽和脂肪酸、礦物元素及多種生理活性物質，日益受到消費者的關注和青睞[8-9]。除螺旋藻外，我國目前已批準的藻類保健食品原料還包括小球藻、鹽藻、雨生紅球藻等[8]。由于可用于保健食品原料的藻類養殖水域可能有其他藻類（如微囊藻、節球藻等）與其共生，因此這些保健食品原料存在被其他藻類所產生毒素污染的風險[8,10]。此外，節球藻毒素化學性質穩定，即使加熱煮沸都難以破壞其結構，在藻類保健食品加工過程中，如果質量控制不嚴格，很有可能將節球藻毒素傳遞至終產品，對消費者身體健康造成潛在危害[10-12]，存在潛在安全風險。截至目前，我國尚未出臺食品中節球藻毒素的限量標準，GB 19643-2016《食品安全國家標準 藻類及其制品》[13]、GB/T 16919-1997《食用螺旋藻粉》[14]均未規定節球藻毒素的檢驗項目。為有效開展藻類保健食品中的安全風險評估，準確識別保健食品中節球藻毒素的污染程度，有必要建立藻類保健食品中節球藻毒素含量的測定方法。

目前節球藻毒素的測定分析方法主要包括酶聯免疫吸附測定法[15-16]、高效液相色譜法[17-18]、液相色譜-質譜法[18-31]等方法，主要集中在水質監測等環境領域[18-27]以及水產品安全領域[28-32]，有關藻類保健食品中節球藻毒素污染情況的研究較少[26-27]，檢測方法靈敏度較差。本研究采用固相萃取樣品前處理技術，并結合高效液相色譜-串聯質譜技術，建立藻類保健食品中節球藻毒素的檢測方法。該方法旨在建立簡便、快速、靈敏度高的檢測方法，對了解藻類保健食品中節球藻毒素污染水平及潛在安全風險具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

節球藻毒素標準溶液（10.21 μg/mL） 青島普瑞邦公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純） 美國Fisher Scientific公司；甲酸（質譜純） 美國Sigma公司；Captiva EMR-Lipid Cartridge（3 mL） 美國 Agilent公司；DisQuE tube（含 150 mg 硫酸鎂、25 mg PSA、30 mg C18和30 mg中性氧化鋁） 美國Waters公司；SHIMSEN QuEChERSdSPE column（含 150 mg硫酸鎂、25mg PSA、25 mg C18） 日本Shimadzu公司；螺旋藻及小球藻等藻類保健食品，包括片劑、膠囊和藻粉 均購自網絡平臺。

LCMS-8060型超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀配有電噴霧離子源（ESI）及LabSolutions（Version 5.99 SP2）數據處理系統 日本Shimadzu公司；AL 204型分析天平和XP205型分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；Vortex Genie 2渦旋混勻器美國Scientific Industries公司；GTR21-1B醫用離心機 北京新時代北利醫療器械有限公司；Arium?pro VF超純水純化系統 德國Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取 樣品稱量前根據不同劑型進行初步處理，其中固體片劑用杵和研缽磨成細粉末；膠囊打開后倒出內部粉末；藻粉無需做進一步處理。準確稱取進行初步處理后的樣品0.5 g（精確至0.0001 g）樣品置于15 mL離心管中，加入5 mL提取溶液（甲醇:水=80:20，v/v），旋渦振蕩 30 s，在 4 ℃ 條件下，8000 r/min離心5 min。

1.2.2 凈化

1.2.2.1 凈化柱凈化 取1.2.1提取步驟中所得上清液 1 mL，經 Captiva EMR-lipid 凈化柱凈化，0.22 μm聚四氟乙烯微孔濾膜過濾，續濾液作為待測溶液。

1.2.2.2 凈化管凈化 取1.2.1提取步驟中所得上清液1 mL，置于DisQuE或SHIMSEN QuEChERSdSPE凈化管中渦旋混合1 min，在4 ℃條件下，8000 r/min離心5 min。上清液經0.22 μm聚四氟乙烯微孔濾膜過濾后待測。

1.2.3 標準溶液的制備 取節球藻毒素標準溶液適量，用50%的甲醇水溶液配制成質量濃度為1 μg/mL的標準儲備溶液。將標準儲備液稀釋成質量濃度為100 μg/L的中間標準溶液。取中間標準溶液適量置于10 mL容量瓶中，用50%的甲醇水溶液稀釋得到質量濃度分別為 0.5、1、5、10、25和 50 μg/L的標準系列工作溶液。

1.2.4 儀器條件

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Infinity Poroshell 120 SB-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相：A 為含有0.01%甲酸的水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序 ：0～3 min，25%～50%B；3～5 min，50%～90%B；5～5.6 min，90%B；5.7～7 min，25%B；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流速：0.3 mL/min。

1.2.4.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；正離子掃描模式；檢測模式采用多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；霧化氣流量為 3 L/min，干燥氣（氮氣）流量為10 L/min，加熱氣（空氣）流量為10 L/min，碰撞氣為氬氣，離子源接口溫度為300 ℃，接口電壓為4.0 kV。質譜采集時間為2.5～4 min。質譜參數見表1。

1.2.5 樣品測定 通過采用本研究方法，對39批次螺旋藻及小球藻等藻類保健食品樣品進行檢測，所有樣品均未檢出節球藻毒素。

1.3 數據處理

實驗數據通過島津LabSolutions軟件采集，導出原始數據后采用OriginPro 2016計算和繪圖。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

配制質量濃度為50 μg /L節球藻毒素標準溶液，經質譜分析，得到目標化合物的母離子。通過對比目標化合物在正、負離子模式下的響應值發現，節球藻毒素在正離子模式下響應較高，因此選擇正離子掃描模式。隨后通過優化電壓及碰撞能，選擇響應最強的2對離子，其中m/z：825.4＞135.2作為定量離子對，m/z：825.4＞227.3作為定性離子對。優化后的節球藻毒素母離子、子離子及質譜參數見表1。

表1 節球藻毒素的質譜參數Table 1 MS parameters of nodularin

2.2 色譜條件的選擇

由于選擇正離子模式掃描，在流動相中加入適量的酸有助于提高目標物質的離子化效率，因此選擇0.1%甲酸水溶液和乙腈作為流動相體系，梯度洗脫。樣品經提取和凈化處理后上機測定，不同凈化方式下的節球藻毒素MRM譜圖見圖2。由圖2可知，采用不同凈化方式凈化后測定，節球藻毒素色譜峰周圍無明顯干擾，說明該色譜條件選擇性良好。

圖2 不同凈化方式下節球藻毒素MRM譜圖Fig.2 MRM spectra of nodularin under different purification conditions

2.3 樣品前處理條件的優化

2.3.1 提取溶劑和凈化方式的優化 本研究比較了6種提取溶劑的提取效果以及3種凈化方式的凈化效果。加標樣品分別采用甲醇溶液比例分別為50%（v/v）、60%（v/v）、70%（v/v）、80%（v/v）、90%（v/v）以及純甲醇等6種提取溶劑提取。然后再分別經Captiva EMR-Lipid Cartridge、DisQuE tube和 SHIMSEN QuEChERSdSPE column 3種凈化裝置凈化后上機測定，加標回收率結果如圖3所示。

圖3 提取溶劑對節球藻毒素回收率的影響（n=3）Fig.3 Effects of extraction solvent on recoveries of nodularin（n=3）

實驗結果表明，不同凈化裝置對同一提取溶劑的凈化效果存在較大差異：當采用SHIMSEN QuEChERSdSPE column進行凈化時，所比較的6種提取溶劑均能取得較好的效果，滿足回收率在80%～120%之間；當采用Captiva EMR-Lipid Cartridge進行凈化時，隨著提取溶劑中甲醇的比例上升，節球藻毒素的回收率先提高后降低；當采用DisQuE tube進行凈化時，隨著提取溶劑中甲醇的比例上升，節球藻毒素的回收率先提高后降低。當提取溶劑中甲醇的比例為80%（v/v）或90%（v/v）時，3種凈化裝置都能取得較好的效果，均滿足回收率在80%～120%之間的需求。當僅考慮提取效果、凈化效果以及方法凈化裝置的通用性時，提取溶劑中甲醇的比例為80%（v/v）或90%（v/v）均可作為候選的提取溶劑。但當甲醇的比例由80%（v/v）提升為90%（v/v）時，隨著甲醇所占比例的增加，凈化后的待測溶液顏色明顯加深，進樣后液相小瓶瓶蓋留有綠色物質殘留，表明隨著提取溶液中甲醇比例增加，樣品中更多的色素成分被提取出來進入待測液中。考慮到色素成分的增加不僅會增大對目標物質檢測的干擾，而且還會污染進樣裝置和質譜系統，因此本實驗最終選擇80%甲醇水溶液（v/v）作為提取溶劑。在實際應用中，可以根據實驗室所在單位對選擇供應商的政策要求、不同凈化方式操作熟練程度，以及不同廠家凈化管（柱）的送貨期、價格等因素靈活選擇。

2.3.2 提取方式的優化 在空白基質中加入節球藻毒素標準儲備溶液25 μL和提取溶劑后，分別采用渦旋提取30 s或超聲5、10、20、30 min提取的方式進行提取，經Captiva EMR-Lipid凈化管凈化后上機測定，通過計算加標回收率考察不同提取方式的提取效率（結果見表2），并對各組數據進行方差分析。從結果可以看出，采用渦旋和超聲不同時間提取的回收率均滿足檢測要求；方差分析計算得到F=1.346，Fcrit=3.478，F＜Fcrit，表明幾種提取方式之間無顯著差異。但是實驗中發現，隨著提取時間的延長，樣品提取溶液顏色變深，說明有更多的色素等雜質被提取出來。為了減少雜質對質譜的污染，試驗最終選擇采用渦旋30 s的提取方式。

表2 不同提取方法時節球藻毒素的回收率和精密度Table 2 Recoveries and precisions of nodularin in different extraction method

2.4 基質效應

采用質譜分析時，基質中的共提取物可能會對待測節球藻毒素儀器響應值產生抑制或增強作用，從而導致含量測定偏高或偏低，影響結果的準確性和可靠性。通過對比基質匹配標準曲線斜率（kM）與溶劑標準曲線斜率（kS）的相對值，可以考察樣品基質對節球藻毒素定量分析結果的影響，期量化評價待測樣品基質對待測組分的影響。當（1-kM/kS）×100%為正值時，則表示基質對待測組分存在抑制作用；當（1-kM/kS）×100%為負值時，則表示基質對待測組分存在增強作用；當（1-kM/kS）×100%為零時，則表示不存在基質效應。具體操作：稱取空白藻粉樣品，用提取液提取并經凈化后用于配制節球藻毒素濃度為0.5、1、5、10、20和 50 μg/L 的基質匹配標準工作溶液；同時用甲醇配制相同濃度的標準工作溶液。分別進樣測定、讀取峰面積、擬合工作曲線并計算曲線斜率，可得基質匹配標準曲線的斜率（kM）數值與溶劑標準曲線的斜率（kS）數值分別為17188和17394。按照式（1）對基質效應影響進行評價：

計算結果表明，與純溶劑配制的標準溶液相比，在空白樣品基質溶液對節球藻毒素質譜響應值的抑制效應約為1.2%。基質干擾對節球藻毒素質譜檢測影響較小，采用純溶劑配制的標準工作曲線可以滿足定量測定要求。

2.5 線性關系考察

分別取1.2.5中的系列標準工作溶液各5 μL按上述條件測定，以目標物質的峰面積為縱坐標（Y），相應濃度為橫坐標（X），繪制得到標準曲線Y=17394X+13267。結果顯示，節球藻毒素含量在0.5～50 μg/L范圍內相關系數（r）為0.9997，線性關系良好。當樣品稱樣量0.5 g時，以3倍信噪比（S/N=3）確定化合物的檢出限（limit of detection，LOD）為 1 μg/kg、10倍信噪比（S/N=10）確定化合物的定量限（limit of quantification，LOQ）為 3 μg/kg。

2.6 加標回收率與精密度

分別在不含節球藻毒素的螺旋藻粉中，添加10、50和250 μg/kg低、中、高3個濃度水平的節球藻毒素標準溶液進行測定，計算平均回收率（n=6）及相對標準偏差（relative standard deviations，RSD），結果見表3。結果表明，節球藻毒素在3個添加水平下的平均回收率范圍在103.6%～114.8%之間，相對標準偏差為3.3%～12.5%，從整體上看，該方法準確度和重現性良好，能夠滿足日常檢測要求。

表3 不同添加水平下節球藻毒素的回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and precisions of nodularin at three different levels (n=6)

3 結論

本研究采用固相萃取方法對樣品進行凈化，并結合UPLC-MS/MS技術，建立了藻類保健食品中節球藻毒素的檢測方法，通過對提取溶劑和凈化條件的優化，樣品經甲醇-水（80:20, v/v）混合振蕩提取，經凈化柱或凈化管凈化，在優化后的儀器條件下，節球藻毒素在線性范圍0.5～50 μg/L上具有良好的線性關系，檢出限為 1 μg/kg，定量限為 3 μg/kg，在低、中、高3個濃度下的平均加標回收率為103.6%～114.8%，相對標準偏差為3.3%～12.5%。通過應用本方法對39批市售藻類保健食品樣品進行檢測，所有樣品均未檢出節球藻毒素。該檢測結果表明：我國藻類保健食品中節球藻毒素的污染風險水平較低，整體較為安全。本方法操作簡便、靈敏度高、定量準確、重現性好，可以實現批量樣品的檢測，適合藻類保健食品中節球藻毒素的定性確證與定量檢測。