基于年齡分層BRAF-V600E基因突變對甲狀腺乳頭狀癌的臨床意義

艾中偉 李興江 董海影 明玥 沈博

【摘要】目的：探討甲狀腺乳頭狀癌患者中BRAF-V600E基因突變的表達情況。方法：選擇2015年1月-2020年12月期間齊齊哈爾醫學院臨床病理診斷中心病理診斷為橋本氏甲狀腺炎并發甲狀腺乳頭狀癌（HT-PTC）、橋本氏甲狀腺炎（HT）以及甲狀腺乳頭狀癌（PTC）患者共135例為研究對象，均行BRAF V600E基因突變檢測，對BRAF V600E基因突變與HT-PTC臨床病理特征的關系進行分析。結果：與PTC組和HT組相比，HT-PTC組的BRAF-V600E突變率較高，組間對比差異明顯（P<0.05），并且PTC組的BRAF-V600E突變率高于HT組（P<0.05）;HT-PTC組的PD-1/PD-L1、ERK、MEK以及KRT19陽性率均高于HT組和PTC組（P<0.05）;同時，BRAF V600基因突變與HT-PTC患者預后、腫瘤分期以及年齡有關（P<0.05），但是與發病部位、頸淋巴結轉移以及腫瘤大小無關（P>0.05）。結論：BRAF V600E突變是女性橋本氏甲狀腺炎發生甲狀腺乳頭狀癌的一個重要誘因，并且與腫瘤分期和年齡有關，也是對HT-PTC患者預后進行判斷的一個獨立因素。

【關鍵詞】甲狀腺乳頭狀癌;BRAF-V600E基因突變;橋本氏甲狀腺炎;病理特征

甲狀腺乳頭狀癌（PTC）是比較常見的一種內分泌惡性腫瘤，其預后較好，術后10年生存率超過90%，但是一些PTC具有較強的侵襲性，容易出現轉移和復發，不僅影響患者預后，也是導致患者死亡的一個重要原因。近年來，在關于甲狀腺癌的分子機制研究中，發現鼠類肉瘤濾過性毒菌（v-Raf）致癌同源體B1（BRAF）基因突變是比較重要的一個因素，BRAF-V600基因突變在PTC患者中的發生率為28%-83%，但是在甲狀腺良性病變組織和正常組織中均未出現。有文獻報道，PTC患者同時往往伴有橋本氏甲狀腺炎（HT），因此明確橋本氏甲狀腺炎與甲狀腺乳頭狀癌的關系，確定橋本氏甲狀腺炎是乳頭狀癌的原因，還是結果，對于甲狀腺乳頭癌的預防、診斷和治療具有重要意義。因此，本文探討了BRAF V600E基因突變與橋本氏甲狀腺炎-甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關系，現報告如下。

資料和方法

1.1一般資料

選擇2015年1月-2020年12月期間齊齊哈爾醫學院臨床病理診斷中心病理診斷為橋本氏甲狀腺炎并發甲狀腺乳頭狀癌（HT-PTC）、橋本氏甲狀腺炎（HT）以及甲狀腺乳頭狀癌（PTC）患者共135例為研究對象，年齡22-78歲，平均（49.5±8.4）歲，其中55例為HT，40例為PTC，40例為HT-PTC。納入標準：（1）臨床資料完善，且行BRAF-V600E基因檢測;（2）腫瘤直徑大小合適;（3）無其他癌癥病史及放療或化療史，無吸煙史;（4）術后病理診斷明確;（5）無甲狀腺、頸部淋巴結病史。排除標準：（1）病理診斷不明確，或者未行頸淋巴結清掃術;（2）未行BRAF-V600E基因檢測;（3）腫瘤直徑過大，不能明確其準確位置;（4）合并其他惡性腫瘤;（5）吸煙史、頭頸部化療以及放療史;（6）甲狀腺或頸部淋巴結病史。

1.2方法

1.2.1實時定量PCR檢測

運用經典Trizol-氯仿法提取組織總RNA，瓊脂糖電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度法測定RNA的濃度及純度。取1μg總RNA，在20μL反應體系中用oligo（d）T引物和SuperScriptⅡ逆轉錄酶進行逆轉錄反應，獲得cDNA產物。根據NCBI數據庫提供的相應基因cDNA序列，用Primer Express Software v2.0設計特異SYBR Green Real-time PCR引物。以cDNA作為模板，在ABI 7000熒光定量PCR儀上的96孔板中用SYBR Green嵌合熒光法進行實時定量PCR反應。mRNA相對表達水平計算公式為2-△△CT，其中△△CT=（CT目的基因- CT看家基因）實驗組-（CT目的基因- CT看家基因）對照組。

1.2.2檢測KRT19蛋白表達

運用Western blot分析KRT19蛋白表達。采用蛋白提取試劑盒分別提取組織蛋白。將提取蛋白加200μL上樣緩沖液，煮沸10 min，室溫放置20 min溶解沉淀，置-80℃保存備用。用BCA法檢測樣品蛋白質濃度后，取50μg蛋白質經10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳2h分離。膠中蛋白質在70mA恒流狀態下4℃過夜電泳轉移至硝酸纖維素膜。膜在5%脫脂奶粉37℃封閉2h。將兔抗小鼠一抗與硝酸纖維素膜4℃培育過夜。與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 37℃溫預1h。用Western印跡熒光發光檢測試劑盒發光、壓片，應用凝膠成像分析系統分析測定各組條帶的積分光密度。同時，檢測KRT19 mRNA，方法與上述基本一致。

1.2.3檢測PD-1/PD-L1表達水平

借助免疫組化（SP三步法）染色法對腫瘤與黏膜組織內PD-L1表達水平進行測定。每次進行免疫組化時均用 PBS 代替一抗作陰性對照，以排除非特異性結合。37℃溫水展片，1%多聚賴氨酸涂片，自然干燥，組織切片覆片，6℃烤片過夜，經二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各 10min，無水乙醇及 95%、85%、75%乙醇各2min 浸泡后，自來水沖洗 2～3min，微波高火抗原修復，孵育 10min，封閉，加一抗和二抗，滴加 HRP 標記的鏈霉卵白素工作液，DAB 顯色，蘇木素復染，封片，拍照。

1.2.4檢測MEK/ERK表達

采用實時定量PCR和Western blot檢測MEK和ERK的表達，方法同上。同時采用免疫熒光法檢測MEK/ERK蛋白表達及磷酸化水平。組織塊放入液氮罐內速凍5min，將其取出后應用冰凍切片機進行冰凍切片，片厚20μm，切片經0.01M PBS清洗，與一抗4℃孵育過夜，0.01M PBS清洗，FITC標記熒光二抗1：1000，避光孵育1.5h，甘油封片。在熒光顯微鏡和圖像處理系統上進行熒光顯微成像。應用ImageJ軟件計算熒光強度。

1.3觀察指標

統計三組的KRT19、MEK、ERK、PD-1/PD-L1以及BRAF-V600E陽性率，收集PTC的臨床病理學特征，包括腫瘤預后、發病部位、腫瘤分期、頸淋巴結轉移區域、頸淋巴結轉移、腫瘤大小以及年齡，并且分析BRAF-V600E突變與PTC病理學特征之間的相關性。

1.4統計學分析

由SPSS20.0軟件分析，其中計數資料由百分率（%）表示，組間比較行X2檢驗，運用t檢驗計量資料對比，以P<0.05表示有差異。

結果

2.1三組BRAF-V600E突變率比較

HT-PTC組、PTC組以及HT組的BRAF-V600E突變率分別為67.5%（27/40）、47.5%（19/40）、1.82%（1/55），組間比較有統計學意義（P<0.05）。

2.2三組MEK、ERK、PD-1/PD-L1以及KRT19陽性率對比

與PTC組和HT組相比，HT-PTC組的MEK、PD-1/PD-L1、KRT19以及ERK陽性率均較高，組間對比有差異（P<0.05），見表1。

2.3HT-PTC臨床病理學特征與BRAF V600基因突變之間的關系

BRAF V600基因突變與HT-PTC患者預后、腫瘤分期以及年齡有關（P<0.05），但是與發病部位、頸淋巴結轉移以及腫瘤大小無關（P>0.05），見表2。

討論

PTC是比較常見的一種內分泌系統惡性腫瘤，具有復雜的發病機制，與基因突變、免疫功能紊亂以及內分泌失調等諸多因素有關。有文獻報道，HT合并PTC具有較高的發病率，約為55%-60%，提示癌變的發生和發展與HT密切相關。HT作為自身免疫性的一種甲狀腺疾病，以體內出現特異性甲狀腺抗體為主要表現，因為漿細胞和淋巴細胞浸潤，可破壞甲狀腺組織結構，從而降低甲狀腺功能。而BRAF基因是比較重要的一個原癌基因，位于人類7號染色體上，編碼RAF家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也是MAPK/ERK信號通路的一個關鍵分子，與黑色素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌以及PTC等有關。研究發現，在甲狀腺其他腫瘤中，BRAF-V600E發生突變較少，僅出現在PTC中，提示BRAF-V600E基因突變是診斷PTC的一個特異性標志物。也有文獻報道，PTC的復發、轉移以及侵襲性與BRAF-V600E位點的突變有關，不僅能夠誘發正常的甲狀腺濾泡細胞腫瘤，還可以促進和維持PTC的侵襲性。在本次研究中，HT-PTC的BRAF V600E突變率高于PTC組和HT組（P<0.05），其中HT組中僅有1例突變，與國內外研究報道基本一致，說明HT是否出現癌變與BRAF-V600E突變有關，并且BRAF-V600E也是導致HT癌變的一個重要危險因素。同時，BRAF V600基因突變與HT-PTC患者預后、腫瘤分期以及年齡有關，提示這一基因位點不僅有助于鑒別甲狀腺良惡性腫瘤，還能判斷患者預后。

綜上所述，BRAF V600E突變是女性橋本氏甲狀腺炎發生甲狀腺乳頭狀癌的一個重要誘因，并且與腫瘤分期和年齡有關，也是對HT-PTC患者預后進行判斷的一個獨立因素。

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