基于葉片形態(tài)特征的金秀羅香鄉(xiāng)茶樹(shù)種質(zhì)資源多樣性分析

檀業(yè)維，彭靖茹，溫立香，黃壽輝，李 嫄，張 芬，陳家獻(xiàn)，袁冬寅

廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所/廣西亞熱帶水果加工工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530001

廣西壯族自治區(qū)來(lái)賓市金秀瑤族自治縣位于廣西中部地區(qū)，年平均氣溫17℃。金秀瑤族自治縣羅香鄉(xiāng)、六巷鄉(xiāng)等都分布有野生茶樹(shù)，加工的紅茶色澤黑潤(rùn)無(wú)毫[1]。羅香鄉(xiāng)位于金秀瑤族自治縣的東南部，具有“晴時(shí)早晚遍地霧，陰雨時(shí)節(jié)滿山云”的氣候，在羅香鄉(xiāng)的羅運(yùn)、羅丹、平竹、大新等村的原始森林內(nèi)，野生茶樹(shù)比比皆是。這就是堪稱(chēng)與“茶祖之鄉(xiāng)”云南古茶相媲美的金秀羅香野生茶[2]。2014年黃亞輝等[3]對(duì)金秀縣47份野生茶資源開(kāi)展形態(tài)學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)金秀茶樹(shù)資源形態(tài)多樣性豐富，并將金秀野生茶樹(shù)分為古陳大葉種、大瑤山長(zhǎng)葉種、共和小葉種三種類(lèi)型。2016年陳瑩玉等[4]采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記，構(gòu)建了廣西金秀縣4 地22 份野生茶資源的分子指紋圖譜，表明廣西金秀縣茶樹(shù)品種明顯的遺傳多樣性和地域獨(dú)特性。2018年莫嵐等[5]對(duì)金秀縣8個(gè)野生茶樹(shù)群體進(jìn)行茶多酚、氨基酸和生物堿等主要生化特征分析，篩選出高茶多酚、高氨基酸和高 EGCG 等特異資源。2018年莫嵐等[6]對(duì)金秀羅香鄉(xiāng)、六巷鄉(xiāng)、金秀鎮(zhèn)和大樟鄉(xiāng)共40份茶樹(shù)資源的兒茶素和氨基酸組分含量進(jìn)行分析，篩選出高氨基酸和高 EGCG等特異資源。目前對(duì)金秀縣茶樹(shù)資源的研究多從分子層面和生化層面探討，而從形態(tài)層面深入對(duì)金秀縣羅香鄉(xiāng)茶樹(shù)資源進(jìn)行探討的較少。作物形態(tài)性狀變化大、復(fù)雜多樣，但因簡(jiǎn)單直觀，便于觀察和獲取，具有便利性，因此形態(tài)標(biāo)記在區(qū)別不同種質(zhì)資源的遺傳學(xué)研究中仍被廣泛應(yīng)用。形態(tài)標(biāo)記已經(jīng)運(yùn)用于甘薯[7-8]、大豆[9]、魔芋[10]和木薯[11]等遺傳多樣性分析，2018年陳濤林等基于葉片等形態(tài)學(xué)性狀對(duì)柳州融水九萬(wàn)山古茶樹(shù)進(jìn)行了聚類(lèi)分析，表明九萬(wàn)山古茶樹(shù)多為中葉型資源[12]。本項(xiàng)目組采集了羅香鄉(xiāng)現(xiàn)有的大部分野生茶樹(shù)種質(zhì)資源，基于葉片形態(tài)對(duì)其種質(zhì)資源多樣性進(jìn)行分析，可為羅香鄉(xiāng)茶樹(shù)資源的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

來(lái)自收集的廣西壯族自治區(qū)金秀瑤族自治縣羅香鄉(xiāng)現(xiàn)有茶樹(shù)種質(zhì)資源，編號(hào)為L(zhǎng)1 ～ L60。

1.2 試驗(yàn)方法

按照《茶樹(shù)種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[13]測(cè)量并記錄茶樹(shù)的葉長(zhǎng)、葉寬、葉片大小、葉形、葉色、葉身、葉脈對(duì)數(shù)等16個(gè)性狀情況，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行賦值，具體如表1所示。

表1 茶樹(shù)葉片形態(tài)標(biāo)記及編碼Table 1 Morphological markers and coding of tea leaf

二元性狀是性狀表現(xiàn)為兩種性狀的；多態(tài)性狀則是表現(xiàn)為兩種形態(tài)以上的性狀。對(duì)數(shù)量性狀進(jìn)行分類(lèi)并分別賦值1、2、3和4級(jí)；X-2s≤1級(jí)＜X-1s，X-1s≤2級(jí)＜X，X≤3級(jí)＜X+1s，X+1s≤4級(jí)＜X+2s，其中X為平均值，s為標(biāo)準(zhǔn)差。

按照《茶樹(shù)種質(zhì)資源數(shù)據(jù)質(zhì)量控制規(guī)范》，茶樹(shù)葉面積計(jì)算公式為：葉面積=葉長(zhǎng)×葉寬×0.7；根據(jù)葉面積大小，葉片大小分為小葉（葉面積＜20.0 cm2）、中葉（20.0 cm2≤葉面積＜40.0 cm2）、大葉（40.0 cm2≤葉面積＜ 60.0 cm2）和特大葉（葉面積≥20.0 cm2）。葉片大小按照測(cè)量的葉長(zhǎng)、葉寬測(cè)量值轉(zhuǎn)化葉面積，轉(zhuǎn)化為多元性狀。

葉片的各形態(tài)特征測(cè)量結(jié)果利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行頻率分析和主成分分析等；系統(tǒng)聚類(lèi)分析方法使用組間聯(lián)接和“平方Euclidean距離”，統(tǒng)計(jì)量為合并進(jìn)程表及相似性矩陣。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片形態(tài)特征

2.1.1 測(cè)量及編碼

根據(jù)茶樹(shù)參數(shù)的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)，60份茶樹(shù)種質(zhì)資源的16個(gè)葉片形態(tài)特征測(cè)定結(jié)果如表2所示，其指標(biāo)編碼后的情況如表3所示。

表2 金秀羅香鄉(xiāng)茶樹(shù)種質(zhì)資源形態(tài)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 2 Morphological characters of tea plant germplasm in Luoxiang

表3 金秀羅香鄉(xiāng)茶樹(shù)種質(zhì)資源編碼結(jié)果Table 3 Coding of tea plant germplasm in Luoxiang

2.1.2 頻率分析

結(jié)果顯示，60份金秀茶樹(shù)種質(zhì)資源的葉片大小主要以小葉和中葉為主，其中中葉占60%。葉形主要有卵圓形、橢圓形、長(zhǎng)橢圓形、批針形，其中以長(zhǎng)橢圓形為主，占66.7%。葉色有四種，以綠色及深綠色最多，其中深綠色占56.7%，綠色占38.3%。葉基絕大部分是楔形，占85%。葉身三種形態(tài)都有，其中以內(nèi)折為主，占90%。葉尖主要有急尖、漸尖、鈍尖，其中漸尖最多，占63.3%；其次是急尖，占33.3%。葉面主要是微隆起，占58.3%；其次是葉面平，占33.3%。葉緣主要是以平為主，占60.0%；其次是微波，占33.3%。葉背均沒(méi)有茸毛。葉質(zhì)硬，占71.7%。葉齒銳度是中，占45%；其次葉齒銳度是鈍，占30%；葉齒銳度是銳的占25%。葉齒密度主要是中（2.5個(gè)/cm≤密度＜4個(gè)/cm）和密（密度≥4個(gè)/cm），其中密的占95.5%。葉齒深度淺、中、深都有；其中以中為主，占45.0%；其次是淺，占41.7%。

2.1.3 主成分分析

由于茶葉葉背茸毛都無(wú)，對(duì)其余的15個(gè)性狀開(kāi)展主成分分析，其解釋的總方差如表4所示。

表4 15個(gè)葉片形態(tài)學(xué)特征解釋的總方差Table 4 Total variance of 15 leaf morphological characteristics

從表4可看出，有6個(gè)成分其特征根大于1，其中葉形特征根為3.336，解釋了總變量的22.24%；葉色特征根為2.042，解釋了總變量的13.61%；葉基特征根為1.631，解釋了總變量的10.874%；葉身特征根為1.602，解釋了總變量的10.680%；葉尖特征根為1.228，解釋了總變量的8.186%；葉面特征根為1.055，解釋了總變量的7.03%。這6個(gè)主成分解釋了15個(gè)總變量的72.621%。可見(jiàn)，在對(duì)茶樹(shù)的葉片進(jìn)行觀察時(shí)應(yīng)著重對(duì)這6個(gè)成分進(jìn)行分析，從而快速區(qū)別茶樹(shù)種質(zhì)。

2.2 聚類(lèi)分析結(jié)果

由于葉背無(wú)差異性，利用SPSS的系統(tǒng)聚類(lèi)分析方法對(duì)除了葉背之外的特征進(jìn)行聚類(lèi)分析，方法使用組間聯(lián)接和“平方Euclidean距離”，統(tǒng)計(jì)量為合并進(jìn)程表及相似性矩陣，依據(jù)葉片形態(tài)特征獲得金秀茶樹(shù)種質(zhì)資源使用平均聯(lián)接（組間）的分類(lèi)樹(shù)狀圖，如圖1所示。

從圖1中可看出，在平方Euclidean距離為25處，60份茶樹(shù)資源主要分為2大類(lèi)。其中第一大類(lèi)只含有1份種質(zhì)L38，L38葉片的主要特征是小葉，葉形卵形，葉色綠色，葉基近圓形，葉身內(nèi)折，葉尖漸尖，葉面與葉緣平，葉背茸毛無(wú)，葉質(zhì)軟，葉齒銳度中，葉齒深度中，葉齒密度密。L38與其它種質(zhì)的鑒別特征是葉形卵形，葉基近圓形。

圖1 金秀茶樹(shù)葉片形態(tài)特征標(biāo)記聚類(lèi)分析結(jié)果Figure 1 Cluster analysis of leaf morphological characteristics of Jinxiucha

第二大類(lèi)包括59份種質(zhì)，在平方Euclidean距離為16處可分為2類(lèi)，其中一類(lèi)只包含L20和L60。這兩份種質(zhì)與其它種質(zhì)的鑒別特征是葉色為黃綠色。兩者在葉片大小、葉齒等方面有差別。L20是小葉，葉齒銳度中，葉齒深度中；而L60是中葉種，葉齒銳度銳，葉齒深度深。其余的57個(gè)茶葉資源可分為兩個(gè)亞類(lèi)。第一亞類(lèi)包含32個(gè)茶樹(shù)資源，與其它種質(zhì)的鑒別特征是葉面隆起性，葉身內(nèi)折。在平方Euclidean距離為10處可分為2個(gè)亞亞類(lèi)，其中第一個(gè)亞亞類(lèi)有L24、L51、L31、L48、L3、L52、L59、L29、L37、L46、L43、L14、L4、L10、L21、L23、L22、L35和L45共19份種質(zhì)；這些種質(zhì)的共同特征是葉片大小為中葉，而葉型、葉質(zhì)等都有差異。第二個(gè)亞亞類(lèi)有L9、L44、L15、L6、L25、L54、L8、L13、L5、L30、L55、L41 和L40共13份種質(zhì)；這些種質(zhì)的共同特征是葉齒密度密。第二亞類(lèi)包含25個(gè)資源，與其它種質(zhì)的鑒別特征是葉尖。在平方Euclidean距離為10處也可分為4個(gè)亞亞類(lèi)，其中第一個(gè)亞亞類(lèi)有L33和 L39。L33是小葉，稍背卷，葉緣微波，葉質(zhì)硬，葉齒深度中；L39是小葉種，葉身平，葉緣波，葉質(zhì)中，葉齒深度淺；其余的形態(tài)特征相同。第二個(gè)亞亞類(lèi)有L47、L50、L57、L53、L36、L42、L11、L12、L16、L17、L27、L56、L32、L34、L49、L18、L26、L1、L2、L58和L28共21份種質(zhì)，這些種質(zhì)的共同點(diǎn)是葉齒深度深。第三個(gè)亞亞類(lèi)只包含L19，葉尖顯著鈍尖。第四個(gè)亞亞類(lèi)只包含L7，葉形最顯著的特征是披針形。

通過(guò)聚類(lèi)分析結(jié)果，我們可以簡(jiǎn)單明了地了解金秀羅香鄉(xiāng)茶樹(shù)種質(zhì)資源葉片形態(tài)特征的多樣性特點(diǎn)，葉形、葉色、葉質(zhì)等相關(guān)葉片性狀是茶樹(shù)品種適制性的重要參考指標(biāo)[12]。通過(guò)本研究對(duì)葉片形態(tài)性狀的分析，發(fā)現(xiàn)金秀縣羅香鄉(xiāng)茶樹(shù)資源葉片形態(tài)性狀變異明顯，變異范圍大，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，其中尤以葉形、葉色等決定茶樹(shù)適制性的重要指標(biāo)變異最為豐富，說(shuō)明在金秀縣羅香鄉(xiāng)茶樹(shù)資源中進(jìn)行優(yōu)異資源的篩選和品種選育是可行的。如果我們需要針對(duì)羅香鄉(xiāng)的茶樹(shù)種質(zhì)資源篩選組建種質(zhì)資源圃，或者開(kāi)展選育種工作，那么可以從聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖的各分枝選取一種資源進(jìn)行即可，這樣可以提高種質(zhì)資源篩選的效率，而且保證葉片形態(tài)特征的全面性。

3 討論

表型性狀是基因的遺傳變異與環(huán)境相互作用的結(jié)果，表型特征的變異能反映出基因型和群體或生態(tài)型的變異。而形態(tài)標(biāo)記具有直觀性，能快速區(qū)分出不同的表型個(gè)體，農(nóng)藝性狀的鑒定和描述仍然是種質(zhì)資源研究的最基本的方法和途徑[14]。按照茶樹(shù)的葉型來(lái)分類(lèi)，茶樹(shù)可以分為特大葉型、大葉型、中葉型和小葉型。通過(guò)對(duì)金秀羅香鄉(xiāng)茶樹(shù)的葉形進(jìn)行分類(lèi)，可知其主要是中、小葉種，這與黃亞輝的調(diào)查基本一致[1]。通過(guò)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)羅香鄉(xiāng)茶樹(shù)的15個(gè)葉片形態(tài)性狀進(jìn)行主成分分析，可知葉形、葉色、葉基、葉身、葉尖和葉面這6個(gè)變量可解釋總變量的72.621%，其余的9個(gè)變量才解釋27.379%，因此這6個(gè)變量可以作為基于茶樹(shù)葉片進(jìn)行分類(lèi)鑒定和篩選的主要指標(biāo)。

對(duì)60份羅香鄉(xiāng)茶樹(shù)資源進(jìn)一步進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果表明羅香鄉(xiāng)茶樹(shù)種質(zhì)資源間變異明顯，變異范圍大，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，其中尤以葉形、葉色等決定茶樹(shù)適制性的重要指標(biāo)變異最為豐富，利用葉片形態(tài)標(biāo)記對(duì)金秀羅香鄉(xiāng)茶樹(shù)資源進(jìn)行初步分類(lèi)鑒定和篩選是可行的。陳瑩玉等利用RAPD分子標(biāo)記對(duì)金秀縣的部分野生茶樹(shù)資源開(kāi)展遺傳多態(tài)性研究，表明其與廣東、福建的茶樹(shù)遺傳距離較遠(yuǎn)[4]，這與本試驗(yàn)結(jié)果羅香鄉(xiāng)茶樹(shù)種質(zhì)資源間變異明顯、變異范圍大相符；莫嵐等通過(guò)對(duì)金秀野生茶樹(shù)的生化成分分析結(jié)果表明，金秀野生茶樹(shù)群體資源的生化成分多樣性豐富，變異范圍大，資源類(lèi)型豐富[5-6]，與本試驗(yàn)葉形、葉色和葉質(zhì)等決定茶樹(shù)適制性的重要指標(biāo)變異豐富的結(jié)果相符，表明金秀野生茶具有較高的利用價(jià)值。黃亞輝已對(duì)羅香鄉(xiāng)羅運(yùn)村的白牛茶生化成分及葉片主要特征開(kāi)展了相關(guān)研究[15]，但是在羅香鄉(xiāng)其他野生茶樹(shù)資源的研究方面還很匱乏。本研究通過(guò)對(duì)羅香鄉(xiāng)部分茶樹(shù)葉片的形態(tài)特性進(jìn)行聚類(lèi)，開(kāi)展分類(lèi)鑒定，為今后對(duì)羅香鄉(xiāng)的茶樹(shù)種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

茶樹(shù)的葉型是我們快速進(jìn)行分類(lèi)及育種的重要依據(jù)，但是由于茶樹(shù)的葉片特征常互有雷同，單純?nèi)~片特征只能做到對(duì)資源進(jìn)行初步篩選歸類(lèi)，很難對(duì)其進(jìn)行徹底分析。若要全面準(zhǔn)確地分析資源特性，需要結(jié)合分子標(biāo)記、生化成分等分析，從多角度作全面的研究。