Wnt 信號通路與肝纖維化的關系

范 欽， 李紅俊， 李曉霞， 楊 尹， 陳海燕， 成家茂

1 大理大學基礎醫學院 解剖學教研室， 云南 大理 671000；2 大理大學臨床醫學院 超聲教研室， 云南省第四人民醫院 超聲科， 云南 大理 671000

肝纖維化是慢性肝損傷后進一步惡化的關鍵性病理過程，是提升肝癌風險的關鍵因素，目前尚無特異有效的治療方法。多種信號通路參與肝纖維化的調控，包括TGFβ、Hedgehog、Wnt、Notch、MAPK、PI3K、NF-κB、Rho、S1P等信號通路。其中，Wnt是一個廣泛存在且高度保守的信號，在創傷修復和纖維化形成過程中與許多器官如肝、腎、肺和心臟的纖維化發生有關[1-2]。越來越多的研究[2]表明，靶向Wnt信號可能是一種新的、有前途的抗纖維化策略。因此，本文就Wnt信號通路及其在肝纖維化中的調控作用進行綜述。

1 Wnt信號通路

1.1 經典Wnt信號通路及其激活 Wnt經典途徑即依賴β-catenin的Wnt/β-catenin信號通路(圖1)，β-catenin是鈣黏蛋白復合物的核心成分，其穩定性對于Wnt/β-catenin信號通路的激活至關重要[3-4]。Wnt信號通路經典途徑包括配體、跨膜受體、胞漿調節蛋白、核內轉錄因子及下游靶基因。Wnt 蛋白是一類富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白，其異常激活還與衰老、腫瘤、炎性和器官纖維化等疾病密切相關[5-8]，而Wnt受體卷曲蛋白(Fzd)及其共同受體低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)5/6同樣富含半胱氨酸結構域，通過此區域二者可直接與 Wnt蛋白特異性結合，形成復合物Wnt-Fzd-LRP5/6，從而啟動經典Wnt信號通路的激活[9-10]。在缺乏Wnt配體的情況下，β-catenin與支架蛋白(Axin)、腺瘤性結腸息肉病蛋白(APC)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)以及酪蛋白激酶1α(CK1α)結合形成β-catenin蛋白降解復合物即“破壞復合體”，致使GSK-3β和CK1α將β-catenin磷酸化，并促進其降解。Wnt信號一旦被激活，便開始招募并激活蓬亂蛋白 (disheveled，Dsh/Dvl)，促進Axin、GSK-3β與LRP聯系，從而破壞“破壞復合體”的活性，β-catenin不能被降解并在胞質中積累，隨后進入細胞核，取代T淋巴細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)家族的轉錄抑制因子Groucho蛋白與之結合，誘導Wnt下游靶基因的轉錄表達[3,11-12]，從而發揮多種生物學作用。因此，Wnt信號通路可概括為：Wnt激活→Wnt-Fzd-LRP5/6復合物形成→Dsh/Dvl活化→β-catenin蛋白降解復合體解散→β-catenin入核 →取代TCF/LEF→下游基因轉錄表達。

1.2 非經典Wnt信號通路及其激活 包括3種非依賴β-catenin的信號通路，即Wnt/Ca2+通路、Wnt/PCP通路、調控紡錘體定向和非對稱細胞分裂的胞內信號通路(SO-ACDic)[3-4,11-13]。以上3種信號通路雖均無β-catenin的參與，但需要Wnt蛋白與受體Fzd結合，然后信號被轉導至Dsh/Dvl，不使用LRP5/6作為其共同受體[12](圖1)。非經典Wnt信號通路主要作用于細胞遷移和細胞極性[3]，其Wnt蛋白家族包括Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a和Wnt11等。此類通路的β-catenin在胞漿內與APC-Axin-GSK-3β復合體結合并被磷酸化，磷酸化的β-catenin被β-轉導重復相容蛋白(β-Trcp)識別并泛素化，隨后被蛋白酶體降解。在哺乳動物中，Wnt/PCP通路是高度保守的信號傳導路徑，它參與了激活c-Jun N-末端激酶(JNK)和Ras同源基因家族成員A(RhoA)級聯，從而靶向控制細胞骨架重排的基因；Wnt/Ca2+途徑主要通過調節細胞內Ca2+升高，隨后異三聚體G蛋白和磷脂酶C(PLC)及其蛋白激酶C(PKC)被Wnt-Fzd 復合物激活，然后激活下游靶基因的表達，從而控制細胞分化的結局，細胞的黏附和遷移[12]。目前，有關SO-ACDic信號通路的研究較少[14]。

圖1 Wnt信號通路的經典途徑和非經典途徑[3-4]

2 Wnt信號通路與肝纖維化

2.1 Wnt信號通路與肝星狀細胞(HSC)的活化 HSC在肝纖維化的發生和發展中起著重要或關鍵性的作用[15-16]。在正常肝臟中，HSC以靜止狀態存在于肝細胞與其周圍肝血竇內皮細胞之間的Disse腔中，呈梭形或多邊形，因胞漿內有多個富含維生素A的脂滴，故又稱Ito細胞或貯脂細胞，可參與肝竇血流的調節，并分泌多種膠原酶和基質金屬蛋白酶(MMP)[16-17]；當肝臟受到損傷和發生纖維化時，HSC激活并發生表型改變，轉化為肌成纖維細胞(MFB)，可表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、波形蛋白、結蛋白等特征性蛋白，大量分泌主要來源于Ⅰ型和Ⅲ型膠原的細胞外基質，在Disse腔的膠原化過程中起主要作用[15]。另一方面，在肝纖維化過程中，TGFβ、血小板源性生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子、結締組織生長因子、表皮生長因子、肝細胞生長因子等細胞因子共同激活HSC增殖、遷移和分泌的信號通路[15-16]，包括TGFβ、Wnt、Hedgehog、NF-κB、Notch、ROCK、MAPK、PI3K等大量通路，以及新發現的NLRP3、Ferroptosis 等信號通路[18-20]。

Wnt信號通路與HSC的活化關系密切，可通過以下幾種主要途徑實現調控。(1)細胞命運決定和形態發生因子：研究[21-23]顯示，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ為脂肪細胞和HSC的分化所必需，可促進脂肪在HSC內的儲存，Wnt/β-catenin與PPARγ、Smads、Shh、NF-κB、Necdin、Notch、DLK1等多種形態發生素相關轉錄因子相互作用，在HSC轉分化為MFB的過程中被激活。(2)Wnt信號相關蛋白酶：近期研究[24]表明，CCl4誘導肝纖維化小鼠的原代HSC中和TGFβ1刺激的LX-2細胞中Polo樣激酶1(PLK1)的表達均有升高，敲除PLK1則可抑制細胞內α-SMA和Col1α1的表達，降低HSC的活化，促進HSC凋亡，而Wnt/β-catenin信號通路可能為PLK1介導的HSC活化所必需。Du等[25]實驗發現，采用血紅素加氧酶-1(HO-1)誘導HSC-T6，能夠下調經典Wnt途徑的關鍵調節因子 Wnt1和非經典Wnt途徑的關鍵調節因子Wnt5a；而采用氯化血紅素誘導則可抑制Wnt途徑中β-catenin和激活T淋巴細胞核因子5的下游因子，表面HO-1通過抑制HSC的生長和促進其凋亡在肝纖維化中發揮保護作用。(3)微小核糖核酸(miRNA)：miR-708可通過Wnt/β-catenin信號通路直接靶向跨膜蛋白TMEM88，通過調節Wnt3a、Wnt2b、Wnt3α的表達及Dvl-1的PDZ結構域，促進HSC的活化和細胞外基質的積累[26]。但另有研究[27]發現，miR-708在纖維化肝組織和活化的HSC中表達受到抑制，伴隨著ZEB1水平的增加，而其過表達和ZEB1的沉默抑制了LX-2細胞的活化與增殖。miR-16可同步靶向整合TGFβ信號通路的Smad2和Wnt信號通路的Wnt3a 等，從轉錄組水平誘導HSC向MFB表型轉化的逆轉，導致肝纖維化的消退[28]。日本血吸蟲卵源性外泌體Sja-miR-1可顯著增加原代小鼠HSC和LX-2細胞內α-SMA、Col1-α1及Col3-α1 mRNA的表達，促進了HSC的活化[29]，而Sja-miR-71a可通過直接靶向 Sema4D來抑制TGFβ1/SMAD和IL-13/STAT6信號途徑，以及通過調節Th1/Th2/Th17和Treg 的平衡來抑制肝纖維化[30]。(4)其他信號相關蛋白：特異性頂部盤狀底板反應蛋白(R-spondin protein，RSPO)為Wnt/β-catenin信號激活因子，研究[31]發現，RSPO3在多器官纖維化的發展中起著關鍵作用，即抗RSPO3抗體OMP-131R10在治療性給藥時，可減輕肝纖維化、肺纖維化和皮膚纖維化，并認為RSPO3在Kupffer細胞和肝細胞中誘導多種促纖維化的趨化因子和細胞因子。Yes 相關蛋白(YAP)是Hippo信號通路中的主要下游蛋白，在CCl4誘導小鼠肝纖維化組織和經TGFβ1處理的HSC-T6細胞中均表達升高，而YAP的缺失可減弱HSC-T6細胞內Wnt/β-catenin信號途徑的活性[32]。Dickkopf-1(DKK-1)是一種分泌性蛋白，可與Wnt受體LRP5/6及穿膜蛋白Kremen1/2結合形成三聚體，阻斷Wnt/β-catenin信號向胞內的傳遞，在慢性HCV相關肝硬化患者中出現顯著升高[33]。β-連環蛋白2相關拮抗劑(Dact2)是一種Wnt信號相關腫瘤抑制因子，Dact2基因的敲除可增強腫瘤侵襲和遷移相關的MMP2、MMP9基因的表達，以及與上皮間質轉化相關的 Snail、VEGF和ZEB基因的表達，也與胰腺和肝臟的纖維化密切相關[34]。鋅指E-盒結合同源異型盒蛋白(ZEB)是鋅指家族的功能蛋白，ZEB1在包括肝纖維化和丙型肝炎在內的多種肝臟疾病中異常表達[35]；ZEB2可通過Wnt/β-catenin信號通路促進肝纖維化的發生發展[27]。

2.2 Wnt信號通路參與肝Kupffer細胞的極化 巨噬細胞通常根據表型和功能分為經典活化巨噬細胞(促炎型，M1-Mφ)和替代性活化巨噬細胞(抗炎型，M2-Mφ)，此外還有腫瘤相關巨噬細胞、CD68+、CD169+和TCR+巨噬細胞等；也可按其分布分為固定性巨噬細胞(如肝、脾、淋巴結的巨噬細胞等)和游走性巨噬細胞(如肺、表皮和腹腔的巨噬細胞等)。M1、M2型屬單核細胞活化后一系列功能狀態的兩個極端，其分化受各種微環境信號的誘導與調節。正常肝臟內主要為固有巨噬細胞即Kupffer細胞，在肝損傷中則由外周血單核細胞衍生的浸潤巨噬細胞和Kupffer細胞兩部分組成[36]。

Wnt信號通路與纖維化器官中巨噬細胞的極化關系密切。早期研究[37]發現，小鼠肝內有14個Wnt、7 個Fzd基因在正常和活化的HSC及Kupffer細胞中表達。當前已有許多研究證明Wnt信號可介導巨噬細胞參與多器官的纖維化形成。Wnt5a通過刺激Yap/Taz介導的M2-Mφ極化來促進腎纖維化[38]。Wnt7a可與肺間充質干細胞(LR-MSC )的Fzd1結合，通過在脂多糖或IL-4誘導極化的M2-Mφ中表達增多，促使LR-MSC向MFB的分化和博來霉素誘導的肺纖維化形成[39]。雖然通過巨噬細胞極化激活Wnt信號以促進肝纖維化的作用機制研究較少，但經Wnt配體如Wnt2b、Wnt3a、Wnt3、Wnt 4、Wnt 10b和Wnt 11等活化的Kupffer細胞、腫瘤相關巨噬細胞和Hepa1-6細胞在肝細胞癌的發生、發展和遷移中卻發揮著重要的作用[40-42]。關于Wnt信號介導肝巨噬細胞或Kupffer細胞調控肝纖維化的研究已不斷深入開展。Corbett等[43]研究發現，Wnt5a在活化的HSC中表達，可通過非經典途徑的Dvl2和pJNK磷酸化，刺激HSC或Kupffer細胞，分別調節HSC的凋亡和TGFβ1、單核細胞趨化蛋白1的表達，并提出活化的HSC可通過非經典途徑Wnt信號啟動自分泌和旁分泌作用，參與肝纖維化的形成。Akcora等[44]研究發現，經典途徑的Wnt配體Wnt1、Wnt3a和Wnt10b，Wnt受體Fzd1、Fzd2及其共受體LRP6在CCl4誘導肝纖維化大鼠和 TGFβ誘導的3T3成纖維細胞中均顯著上調，趨化因子CXCL12可通過經典的Wnt/β-catenin途徑促進HSC活化，刺激巨噬細胞向肝臟募集，增強肝內炎癥、血管生成和纖維化，而Wnt/β-catenin/TCF介導的轉錄抑制劑 ICG-001則可減輕這些反應。

2.3 Wnt信號通路與肝祖細胞(hepatic progenitor cell，HPC)的活化 HPC為肝內一類具有干細胞功能特點的未分化細胞，又稱卵圓細胞，可分化為肝細胞或膽管上皮細胞[45-46]。近幾十年的證據顯示，在脂肪肝原位肝移植后和膽汁淤積的膽總管結扎模型中，HPC發生間質轉化并導致肝纖維化，并有HSC、巨噬細胞、肝竇內皮細胞等膽管周圍細胞集群的參與，尤其是在慢性肝損傷后的晚期肝纖維化或肝硬化中有助于肝再生，生成新的肝實質細胞[46]。在慢性肝病中，調節HPC的因素在很大程度上仍然未知，但最近有報道[47]顯示，Wnt、Notch、YAP35和Hedgehog信號均參與調控HPC。

Boulter等[48]研究發現，在人類病變肝臟和膽管炎小鼠模型中，MFB通過Notch配體Jagged1的表達啟動HPC內的Notch信號，促使HPC向膽管細胞的分化；而巨噬細胞通過誘導Wnt3a的表達啟動HPC內的經典Wnt信號，從而維持HPC內命運決定因子Numb的表達，并促進HPC向肝細胞分化這一特性。Carpino等[49]研究發現，在兒童非酒精性脂肪性肝病中，M1-Mφ的極化與非酒精性脂肪性肝病的活動評分、膽管反應和門靜脈纖維化密切相關，并伴隨著巨噬細胞內Wnt3a的表達，關系到HPC內的β-catenin磷酸化及其對肝細胞命運的應答，表明巨噬細胞的極化可通過Wnt3a產生驅動HPC的應答，對兒童非酒精性脂肪性肝病的進展發揮關鍵性作用。

研究[50]顯示，在乙硫氨酸誘導的小鼠肝損傷中，通過下調Atg5基因的表達以抑制自噬，可阻礙HPC的分化和抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，并發現在人的肝纖維化組織中，自噬可通過調節體內Wnt/β-catenin信號來調節HPC的肝細胞分化。在向肝細胞分化的大鼠HPC細胞系WB-F344中，自噬可高度激活HPC并在分化為肝細胞的過程中逐漸減弱，同時出現Wnt3a信號下調而Wnt5a信號上調，表明自噬可通過Wnt信號通路調節HPC的肝細胞分化[51]。

3 小結

Wnt信號與肝纖維化的相關性研究是抗肝纖維化治療不容忽視的一個問題。肝內不同細胞通過分泌細胞因子或轉錄因子而發揮調控Wnt信號通路以及其他信號通路的作用，如TGFβ1、JAK/STAT、Hedgehog、NF-κB、Notch、Necdin、MAPK、BMP2等。圍繞Wnt信號如何參與細胞內調節，研究者們從HSC或Kupffer細胞或HPC方面做了詳細的分析。除以上角度外，筆者認為Wnt信號還可能與細胞自噬、細胞形態發生與分化、上皮細胞-間充質轉化、腸道微環境等存在密切的聯系。雖然眾多學者對于Wnt信號調控肝纖維化發生發展和轉歸的具體機制進行了多方面的研究，但在這些研究中尚存在部分欠缺與不足。未來進一步深入研究Wnt信號與肝纖維化的關系，將對探索可控制甚至可逆轉肝纖維化的發生發展具有重要臨床意義。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：范欽、李紅俊、李曉霞、楊尹負責查找文獻，資料分析，撰寫論文；成家茂、陳海燕負責擬定寫作框架，指導思路并修改稿件和最后定稿。