肝臟駐留自然殺傷細胞在肝細胞癌發生發展中的作用

王俊旗， 徐 鋒

中國醫科大學附屬盛京醫院 普通外科， 沈陽 110004

目前，原發性肝癌仍是威脅人類健康的重要癌癥，其中肝細胞癌(HCC)約占85%[1]。針對HCC，由于傳統治療手段(如手術切除、肝移植、消融、放化療等)的局限性，免疫治療有望成為一種能讓更多患者受益的治療手段[2-3]。然而，當前針對免疫檢查點(如PD-1、CTLA-4)的治療僅在一部分HCC患者中產生持續效應。免疫檢查點治療主要作用于T淋巴細胞，而肝臟作為免疫器官，先天性淋巴細胞(innate lymphoid cells，ILC)約占肝淋巴細胞的65%，這些ILC在肝臟抗病原體和抗腫瘤過程中同樣發揮著重要作用，可能成為免疫治療研究的新方向[4-5]。在ILC中，自然殺傷(natural killer，NK)細胞具有促進肝免疫耐受和抗腫瘤的雙重作用[5-6]。最近有研究[7-8]發現，肝臟中存在一種獨特的NK細胞亞群，它們以組織駐留的形式常駐于肝臟中且表現出與傳統NK(conventional NK，cNK)細胞不同的表型和發育特征，這種NK細胞被稱為肝臟駐留NK(liver-resident NK，LrNK)細胞。隨著對LrNK細胞的進一步研究，其功能和作用逐漸明晰。本文重點綜述LrNK細胞在HCC研究中的最新進展，并探討其在HCC免疫治療中的潛在價值。

1 LrNK細胞

1.1 小鼠LrNK細胞 LrNK細胞最早發現于小鼠肝臟內，當時被稱為“凹陷細胞”，后經研究證實，它是駐留在肝竇中具有高度細胞毒性的NK細胞[9]。通過細胞表面標志物CD49a和DX5可將小鼠肝臟NK細胞劃分為CD49a+DX5-和CD49a-DX5+兩類，前者為LrNK細胞，后者類似于脾臟cNK細胞[10]。兩者的發育路徑不同，分別由共同輔助樣先天淋巴祖細胞和NK祖細胞發育而來，且LrNK細胞中成熟相關表面標志物(如CD11b、Ly49受體、CD43和KLRG1)的表達水平更低[10-11]。小鼠LrNK細胞具有較強的組織駐留特性，只存在于肝竇血液中，而不存在于肝臟的輸入和輸出血液中[10]。

1.2 人LrNK細胞 在人肝臟中存在大量從血液轉運而來的未成熟CD16-NK細胞，這些NK細胞在肝內可以分化為CD49a+和CXCR6+NK細胞，從而駐留在肝臟[12]。此外，近50%的肝臟NK細胞為CD56+，且都位于肝竇內。肝內CD56+NK細胞表達多種趨化因子受體如CCR5和CXCR6，這些受體與NK細胞的肝臟駐留密切相關。它們能促使NK細胞選擇性地向其相應的配體遷移(如CCR5配體CCL3、CCL5，以及CXCR6配體CXCL16)并與之結合使NK細胞駐留于肝組織[5,13]。研究[5]表明，某些趨化因子(如CCL3、CCL5、CXCL16)選擇性存在于肝竇間隙，這有助于表達CCR5和CXCR6的CD56+NK細胞特異性地駐留于肝竇內。與CD56+NK細胞相比，CD56-NK細胞不表達上述趨化因子受體，而表達與循環免疫細胞歸巢到周圍組織有關的趨化因子受體如CX3CR1，在轉錄和表型上與外周循環中的NK細胞更相似。

然而，CD56和CXCR6的表達都不能準確定義人LrNK細胞的肝臟駐留特性，因為外周組織和血液中也存在CD56+和CXCR6+NK細胞群。目前存在一種共識，即區分人類cNK細胞和LrNK細胞的最好方法是通過轉錄因子T-bet和Eomes的表達。Eomes高表達T-bet低表達(EomeshiT-betlo)NK細胞約占人類肝臟NK細胞的50%，但完全不存在于血液之中，并且與CD56+和CXCR6+細胞群大部分重疊。盡管如此，人肝臟中的EomeshiNK細胞群體與CD49a+NK細胞群體并不重疊，這表明在人類肝臟中可能存在兩種類型的LrNK細胞，其中CD49a+LrNK細胞存在于肝實質，而EomeshiT-betloNK細胞則存在于肝竇內[14]。總之，仍需更多研究發現新的細胞表面標志物去準確定義人LrNK細胞。

2 LrNK細胞免疫功能

2.1 免疫記憶 作為固有免疫系統的重要組成部分，ILC由于缺乏RAG重組酶而不能表達多種抗原受體，因此過去人們認為其不具有適應性免疫功能(即免疫記憶)。但最近的研究[15-16]發現，在特定條件下ILC也能顯示出其潛在的記憶功能。Peng等[10]證實了小鼠LrNK細胞能夠在半抗原的刺激下介導接觸性超敏反應并產生記憶應答，當機體再次接觸相同半抗原時能增強NK細胞殺傷作用。

芳烴受體(aryl hydrocarbon receptor，Ahr)是一種受外源性和內源性配體調節的轉錄因子，對屏障部位免疫細胞的穩態起著重要作用。在小鼠肝臟中， LrNK細胞穩定表達Ahr，且Ahr能維持LrNK細胞的半抗原記憶功能[17]。此外，人類CD49a+LrNK細胞能夠表達殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptors, KIR)和NKG2C，且在體外培養長期擴增后仍能保持原有表型，這都說明人類LrNK細胞也可能具有適應性免疫功能[18]。然而，LrNK細胞成熟相關表面標志物的表達水平較低，說明其相對于cNK細胞來說較不成熟，這種幼稚性并不利于免疫記憶。因此，LrNK細胞的免疫記憶功能還有待進一步研究。

2.2 免疫調節 肝臟不同部位的LrNK細胞在免疫調節功能上有所不同。人肝實質中的CD49a+LrNK表達MHC-Ⅰ類受體和細胞毒性效應分子，這可能與識別并殺死病毒感染或癌變的肝細胞有關；而存在于肝血竇中的EomeshiLrNK則較少表達MHC受體，它們可能更多地識別來源于腸道的細菌及其產物，并產生殺傷作用[14]。此外，與血液中的NK細胞相比，EmosehiLrNK細胞表面刺激性受體(NKp44、NKp46和NKG2D)表達增加，細胞毒性作用增強但產生促炎癥細胞因子(如IFNγ)的能力降低[13]。這表明LrNK細胞也許能在保留免疫監視功能的前提下削弱自身促炎癥作用對組織的病理損傷。有研究[19-21]發現，LrNK細胞與T淋巴細胞之間存在著相互調節的作用。一方面，CD8+T淋巴細胞通過CD70/CD27信號促進未成熟的CD27+LrNK細胞向成熟的CD27LrNK細胞轉化；另一方面，LrNK細胞可以通過免疫抑制信號PD-1/PD-L1來削弱肝內T淋巴細胞的抗病毒作用。還有研究[22]報道，小鼠LrNK細胞中的DX5-CD11chi亞型能夠通過抑制CD4+T淋巴細胞的增殖從而抑制自身免疫性膽管炎的進展，并且這種抑制作用在炎癥環境下尤為明顯。目前，對LrNK細胞免疫調節功能的認識尚不深入，還需更多研究去闡明其免疫調節作用的內在機制。

3 LrNK細胞與HCC的發生發展

3.1 LrNK細胞與肝炎、肝纖維化以及肝硬化 肝炎、肝纖維化以及肝硬化是HCC發生發展過程中的重要環節，LrNK細胞在這些肝臟疾病中均發揮一定作用[23]。病毒性肝炎初期，NK細胞能夠直接識別并清除病毒感染的肝細胞，但CD8+T淋巴細胞仍是發揮抗病毒作用的主要免疫細胞[24-25]。Zheng等[25]通過建立小鼠HBV肝炎模型，發現cNK細胞能夠通過產生IFNγ誘導CD8+T淋巴細胞的活化，從而間接發揮抗HBV的作用，但LrNK細胞卻不存在上述調節作用。另有研究[26-27]表明，在病毒性肝炎進展中，盡管LrNK細胞表面激活性受體NKp46和NKG2D表達有所上調，但腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)的表達下調以及脫顆粒能力的減弱,最終導致LrNK細胞的細胞毒性受損。在肝纖維化過程中，γδT細胞能通過CD137/CD137L信號促進LrNK細胞的活化并上調其表面細胞毒性效應分子(如穿孔素) 。活化的LrNK細胞能夠誘導肝星狀細胞(HSC)凋亡，并且有效殺傷活化的HSC，從而抑制肝纖維化的進程[28]。然而，在肝纖維化進展為肝硬化的過程中，LrNK細胞中NKp46和穿孔素的表達均減少，其對HSC的殺傷作用也明顯減弱[29-31]。LrNK細胞在不同肝臟狀態下的功能改變如圖1所示。

注：a，在正常肝臟中，LrNK細胞高表達NKp44、NKp46和NKG2D，低表達IFNγ[13]；b，在病毒性肝炎中，LrNK細胞NKp46和NKG2D表達水平升高，但其TRAIL的表達以及脫顆粒能力減弱[26-27]；c，在肝纖維化和肝硬化中，LrNK細胞NKp46、CD161的表達及穿孔素的分泌減少，且對HSC的殺傷活性受到抑制[29-31]；d，在HCC中，LrNK細胞免疫檢查點(TIM-3、LAG-3、TIGIT)表達上調，且抗腫瘤活性(NKG2D、TRAIL、FASL)受到抑制[32-34]。

3.2 LrNK細胞在HCC進展中的作用 NK細胞具有很好的抗HCC活性，但在HCC的進展過程中，NK細胞的數量及細胞毒性發生了改變。不同分期HCC患者的肝內NK細胞數量均有所減少，且這種減少在晚期(Ⅱ期和Ⅲ期)HCC患者中尤其顯著[35]。此外，與早期(Ⅰ期)HCC患者相比，晚期HCC患者肝內NK細胞分泌顆粒酶B和穿孔素的能力明顯下降，細胞毒性嚴重受損[35]。這說明隨著HCC的進展，肝內NK細胞的數量下降、功能受損，最終導致腫瘤的免疫逃逸。與之相似，LrNK細胞在HCC進展中的不同時期也發揮著不同的作用。早期HCC中，LrNK細胞通過NKG2D、TRAIL和FASL等表面受體能夠有效清除癌變的肝細胞，維持正常肝臟微環境的穩態[34]。然而，隨著HCC的進展，逐漸形成的HCC微環境影響了LrNK細胞的抗腫瘤活性。例如，在乳酸富集的HCC微環境中，LrNK細胞內乳酸水平升高，由于自身NKp46、CD107a和顆粒酶B表達下調或線粒體誘導的細胞凋亡而失活[36]；IFNγ能夠增強造血前體細胞的增殖促進LrNK細胞的發育，但HCC微環境中IFNγ水平明顯下降，這可能通過減少LrNK細胞的數量削弱其抗腫瘤作用[20-21,37]。

免疫檢查點作用機制是腫瘤進展的重要原因之一。T淋巴細胞表面的免疫檢查點(如PD-1、CTLA-4)能通過抑制其腫瘤殺傷活性而促進HCC細胞的免疫逃逸，且HCC微環境中的T淋巴細胞高表達免疫檢查點分子是晚期HCC的一個重要特征[38]。在HCC進展過程中，腫瘤浸潤性LrNK細胞表面免疫檢查點T淋巴細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域蛋白3(T cell immunoglobulin and mucin domain 3, TIM-3)的表達明顯上調。TIM-3與HCC組織中的磷脂酰絲氨酸相互作用后發生磷酸化，磷酸化的TIM-3與PI3K的p110亞基競爭結合p85，隨后抑制下游的Akt/mTORC1信號，導致LrNK細胞分泌細胞因子減少、細胞毒性作用減弱[39]。最新的研究[33,39]表明，除了TIM-3外，HCC組織內的LrNK細胞還高表達PD-1、LAG-3、TIGIT等免疫檢查點分子，且瘤內表達免疫檢查點LrNK細胞所占比例越高的患者更容易出現癌栓和無腫瘤包膜，總生存期和無病生存期也較短。總之，在HCC微環境的影響下，晚期HCC組織中的LrNK細胞免疫檢查點分子表達上調，免疫功能受損，且可能導致患者預后不良。這說明針對LrNK細胞的免疫治療可能對晚期HCC患者有益，但仍需更多研究進一步闡明免疫檢查點在LrNK細胞中的作用機制及相關免疫治療的可行性。

4 小結與展望

目前，對于小鼠LrNK細胞的定義較為明確，而人LrNK細胞的定義則主要靠細胞表面標志物(如CD49、CD96、CXCR6)和轉錄因子(如Eomes、T-bet)，且存在一定的爭議。如今公認的人LrNK細胞表型主要包括CD56+CD49a+CD69+CD103+CXCR6-和CD56+EomeshiCD69+CD103-CXCR6+，但也有報道[40-41]稱CD56+CD49e-CD69+CXCR6+NK細胞具有肝臟駐留特性。LrNK細胞可能具有記憶功能且能發揮較強的細胞殺傷作用，這對于機體的抗腫瘤免疫具有十分重要的意義。在HCC的發生發展過程中，LrNK細胞受到HCC環境中多種因素的影響而功能受損，同時通過上調相關免疫檢查點的表達促進HCC的免疫逃逸。綜上所述，LrNK細胞作為新近發現的組織駐留性NK細胞，有望成為HCC免疫治療的新靶點，但其發揮免疫作用的機制仍需要進一步探索。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：王俊旗、徐鋒負責課題設計，收集數據，資料分析，撰寫論文并最后定稿。