鞘磷脂酶在肝細胞癌中的作用

姚 春， 張廣發， 樂瀅玉， 毛德文， 張榮臻， 劉 茵

1 廣西中醫藥大學 研究生院， 南寧 530222； 2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院 肝病一區， 南寧 530023

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是與癌癥相關死亡的第4大常見原因，也是最常見的原發性肝癌，占所有病例的85%～90%[1]。HCC的病因病機尚未完全明晰，但多與肝炎病毒感染、肝硬化、代謝相關脂肪性肝病、酒精性肝病、糖尿病以及各類致癌物質等密切相關，其中肝硬化以及未經抗病毒治療的慢性乙型肝炎是我國HCC發病的主要病因。肝硬化是HCC發生過程中最重要的環節，85%～95%的HCC具有肝硬化背景，而慢性HBV相關肝硬化是我國HCC的首要病因[2]。該病具有起病隱匿、發病迅猛、預后極差、惡性率及轉移率高等特點，并且早期缺乏典型的癥狀和特異性的檢測指標，這給疾病的早期診斷及治療帶來困難，也給患者的經濟及社會醫療帶來沉重負擔，儼然已成為威脅全球公共衛生健康的難題。因此，進一步深入研究HCC的發病機制，尋找新的潛在診斷標志物以及療效確切的治療藥物顯得尤為重要。

鞘脂(sphingolipids,SL)是一類以鞘氨醇為基本骨架的生物膜結構組分，在動植物及微生物中廣泛存在。SL種類繁多，其中神經酰胺 (ceramide,Cer)和1-磷酸鞘氨醇是處在鞘脂類代謝網絡中核心位置的脂質生物調控分子，具有調節細胞生物學功能的重要作用，參與基因表達、細胞增殖分化及凋亡等多種生物學過程。Cer可由絲氨酸和棕櫚酰輔酶A在內質網中重新合成或由鞘磷脂酶(sphingomyelinases,SMase)水解鞘磷脂 (sphingomyelin,SM)等不同途徑產生[3]。Cer作為誘導性刺激過程中起關鍵性作用的第二信使, 在細胞信號傳導中起重要作用，其通過參與和介導肝癌細胞的凋亡過程而抑制肝癌的生長；相反，1-磷酸鞘氨醇則能拮抗Cer的促凋亡作用, 并可通過刺激血管的生長而促使腫瘤的形成[4]。SMase是調節鞘磷脂類信號通路及其相關產物代謝的主要酶類，參與了SM復雜代謝過程中的關鍵步驟。近年來，許多研究表明SMase與HCC的發生發展密切相關，SMase可通過調節腫瘤干細胞的凋亡和增殖來促進肝臟腫瘤的發展。本文就SMase在HCC發生發展中的確切作用進行歸納和探討，以期為其臨床治療提供新的思路和參考。

1 SMase的分類和生物學特性

根據酶促反應的最佳pH值和亞細胞定位，SMase包含3個類型：酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,ASMase)、中性鞘磷脂酶(neutral sphingomyelinase,NSMase)和堿性鞘磷脂酶(Alkaline sphingomyelinase,Alk-SMase)[5]。ASMase是由Smpd1基因編碼的鞘磷脂類代謝的溶酶體酶，其酶促活性最佳pH值為4.5～5.0，在各種類型的細胞中廣泛表達[6]。根據前體蛋白轉運途徑的不同，將ASMase分為細胞內溶酶體型和細胞外分泌型2種形式[7]。溶酶體型ASMase主要通過溶酶體途徑水解產生，分泌型ASMase主要通過高爾基體分泌途徑運輸而產生；ASMase的產生所涉及的機制尚未完全明晰，但多與Zn2+有關，溶酶體型ASMase 需移位至質膜上與細胞外Zn2+結合才能被激活，分泌型ASMase在胞內與外源性Zn2+結合完成酶促活化[8]。ASMase的主要作用是催化SM轉化為Cer和磷酸膽堿，參與細胞增殖分化、存活和通透性等多種信號傳導過程，并在介導衰老、凋亡和自噬方面也發揮著關鍵作用[9-10]。

NSMase是神經鞘磷脂水解酶家族的重要成員，生理值(pH=7.4)是其激活的最適環境，同時鈣、錳、鎂陽離子在調節NSMase生物學活性中也發揮著關鍵作用。研究[11-13]發現，在哺乳動物細胞中存在3種亞型NSMase，分別是由Smpd2、Smpd3和Smpd4基因編碼的NSMase-1、NSMase-2和NSMase-3，NSMase-1主要存在于內質網和高爾基體中，NSMase-3主要存在于骨骼肌和心肌細胞中而在肝臟中則不存在，而NSMase-2廣泛存在于質膜的胞質面，在質膜的胞質面、多層體和核膜上通過特異性水解SM的磷酸膽堿頭基從而調控胞內第二信使Cer水平。此外，NSMase-2受TNFα和IL-1β細胞因子調控，參與介導細胞應激和炎癥反應[14]。

Alk-SMase是一種在腸道黏膜中表達(人體肝臟中也有表達)的細胞外酶，主要存在于胃腸道和人體膽汁中，具有組織表達特異性、膽汁鹽依賴性和胰酶消化抵抗性等特點。研究[15-16]表明，Alk-Smase通過水解SM產生凋亡分子Cer，具有抗炎、抗癌和調控細胞增生凋亡等作用，并可作為肝膽疾病早期診斷的標志物。

2 SMase的信號傳導和調控機制

SMase的酶活性可導致Cer在特定的離散胞內位點快速而短暫的釋放，但NSMase和ASMase作用的機制與信號通路途徑有所不同。NSMase和ASMase位于不同的雙膜層中，它們分別在質膜和溶酶體中水解特定的SM。NSMase誘導的Cer在質膜附近生成，主要激活蛋白激酶C δ亞型、Ras激酶抑制因子或c-Jun氨基末端激酶等特定靶點，參與細胞生長、凋亡和癌癥等生物學過程。ASMase激活產生的Cer已被證明能夠靶向MAT1A基因和組織蛋白酶D以及c-Jun氨基末端激酶，并參與調節自噬、肝纖維化和溶酶體膜通透性。分泌型ASMase在水解質膜外葉處的SM過程中，產生的Cer會誘發細胞凋亡抑制因子CD95和脂肪酸合成酶配體結合，從而進一步介導脂肪酸合成酶誘導肝損傷和衰竭。

2.1 中性鞘磷脂酶(NSMase) NSMase 的不同亞型之間的同源性較低，參與鎂結合和催化活性的關鍵殘基(“催化核心”殘基)均高度保守，因此幾乎所有亞型的NSMase的催化活性都強烈依賴于鎂或錳等陽離子。NSMase-1是一種具有423個氨基酸的完整膜蛋白質，分子量為 47.6 kDa，在氨基酸序列上與肌醇磷酸鞘脂酶C顯示出顯著的同源性，而在C端具有兩個假定的跨膜結構域。研究[17]表明，NSMase-1 對于應激反應中的Cer生成起重要作用。在T淋巴細胞雜交瘤細胞中，通過反義RNA特異性抑制NSMase-1可減少T淋巴細胞受體介導的細胞凋亡，降低T淋巴細胞受體應答過程中的Cer水平、IL-2的產生和促分裂原活化蛋白激酶的激活。因此，NSMase-1衍生的Cer可能是T淋巴細胞受體信號機制的重要組成部分。此外，在斑馬魚胚胎細胞中，通過反義寡核苷酸抑制NSMase-1抑制了Cer的生成、caspase-3的活化和熱應激誘導的細胞凋亡[18]。NSMase-2是一種具有655個氨基酸的蛋白質，分子量為71 kDa，具有C端催化結構域、兩個 N 端疏水片段，兩者之間有200個殘留的膠原樣三螺旋。NSMase-2作為一種磷蛋白，其活性除了對中性pH和二價陽離子有特殊要求之外，還受磷酸化、脂質結合及信號蛋白結合等多種途徑調控，并參與細胞凋亡、生長抑制、炎癥反應等多種生理病理學過程[19]。在MCF-7細胞中，柔紅霉素可特異性上調NSMase-2 mRNA和蛋白質表達水平，NSMase-2啟動子區域中的某些Sp1基序在柔紅霉素的轉錄以及細胞死亡誘導中發揮關鍵作用，而對NSMase-1和NSMase-3沒有任何影響[20]。此外，NSMase-2還與細胞生長抑制和腫瘤發生密切相關。研究[21]表明，細胞融合通過視網膜母細胞瘤蛋白的低磷酸化和細胞周期抑制因子p21的誘導，過表達NSMase-2的細胞在指數期后期表現出較慢的細胞生長，證實了NSMase-2在細胞生長調控中的作用。NSMase-2 mRNA和蛋白質表達水平的上調導致G0/G1期細胞周期阻滯，抑制了細胞周期的進展。此外，Cer水平增加，特別是在極長鏈C(24∶1)和C(24∶0)的Cer水平[21]。因此， NSMase-2是調節炎癥、細胞生長和凋亡等生物學過程的潛在靶點，在癌癥發生發展中扮演重要角色。

2.2 酸性鞘磷脂酶(ASMase) ASMase介導的Cer生成調控多種信號通路，在細胞代謝、Ca2+調節、自噬和溶酶體穩態等方面起著重要作用。因此，ASMase是調節多種細胞過程的重要信號分子。

內質網是蛋白質合成、折疊、成熟和分泌的重要細胞器。內質網應激(endoplasmic retieulum stress，ERS)是指內質網中錯誤折疊蛋白的積累從而觸發非折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)。UPR是一個復雜的信號網絡，旨在通過減少蛋白質合成和增加蛋白質折疊來恢復蛋白質穩態[22]。此外，細胞還可以通過UPR激活一系列信號通路來維持內質網穩態。UPR的激活是通過轉錄因子6a、蛋白激酶R樣內質網激酶 (PERK) 、肌醇需求酶1α (IRE1α) 3種跨膜受體信號蛋白和主要調節因子葡萄糖調節蛋白78 (GRP78)介導的[23-24]。在生理條件下，GRP78與 IRE1α、PERK 和 ATF6結合并阻止其激活, 然而錯誤折疊的蛋白質積累后GRP78被釋放，轉錄因子6a、PERK、IRE1α啟動UPR。經外源性 ASMase 處理的肝細胞可通過Cer的產生和對 Ca2+信號的影響以誘導內質網Ca2+穩態的失衡，Ca2+由Cer觸發釋放到細胞質中會抑制GRP78與UPR傳感器的結合能力，從而導致ERS[25]。

自噬是一個高度調控和復雜的分解代謝過程，通過自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，參與功能失調細胞成分的降解，如線粒體及過氧小體細胞器、蛋白質聚集體或炎癥小體[26]。自噬介導了許多肝臟疾病的進展，其中自噬缺陷可促進脂肪變性和纖維化發展進程[27]。ASMase在自噬介導的肝損傷中發揮作用，來自ASMase-/-小鼠的肝細胞表現出自噬通量的受損，具體表現為線粒體功能失調的積累和對高脂飲食誘導的肝脂肪變性的抵抗[28]。

溶酶體是專門的膜結合細胞器，含有多種水解酶，其在細胞死亡調節中起著至關重要的作用，其中溶酶體膜通透性和溶酶體內容物的泄漏足以引發細胞凋亡[29]。ASMase 缺乏會導致原代小鼠肝細胞對棕櫚酸 (palmitic acid, PA)誘導的脂毒性產生耐藥性。與對PA介導的脂肪毒性的抵抗一致，來自ASMase-/-小鼠的肝細胞也對兩親性溶酶促洗劑誘導的細胞死亡產生了抵抗。ASMase缺乏時溶酶體中膽固醇水平的增加參與了這種保護，因為降低溶酶體膽固醇含量會逆轉ASMase-/-肝細胞對兩親性溶酶促洗劑和PA誘導的細胞死亡的耐藥性[28]。因此，ASMase的缺乏會上調溶酶體膽固醇，從而導致溶酶體膜通透性的減少和對PA誘導的脂肪毒性的抵抗。

3 SMase與HCC

HCC早期癥狀不明顯，確診時多數患者已處于晚期而錯過手術治療的最佳時機。目前，有效的非手術治療手段有限且效果欠佳，而且晚期 HCC 會對化療產生耐藥性，故早期診斷對HCC患者提高生存率至關重要[30-31]。肝細胞凋亡抵抗和代償性增殖是HCC發生發展的關鍵驅動因素，也是治療失敗的主要原因。因此，尋找促進細胞凋亡和抑制 HCC 生長的分子靶點顯得極為迫切，而SMase在HCC的發生發展及診療中具有重要潛在生物學價值。

3.1 NSMase在HCC中的作用 SL因參與調節癌細胞增殖和凋亡以及對化療藥物的反應而受到認可，Cer是SL代謝的核心分子，參與細胞凋亡、細胞周期停滯、細胞增殖、細胞遷移、衰老和炎癥等生物學過程。因此，參與 Cer 合成分解代謝的相關基因、酶和脂質也在癌癥進展中發揮重要作用。SL可以通過介導細胞凋亡途徑，靶向調控Cer水平，從而抑制HCC的進展。研究[32]表明，與非腫瘤組織相比，HCC組織中的Cer水平顯著降低而SM表達水平較高。因此，SMase活性受損可能是其潛在機制之一。此外，塞來昔布通過介導ERS激活誘導Cer從頭合成，從而增強肝癌HepG2細胞的凋亡，抑制肝癌的進展[33]。研究[34]表明 ，NSMase-1在 HCC 中下調并與 HCC 患者的預后密切相關，與高 NSMase-1 患者相比，低 NSMase-1 表達的 HCC 患者的生存時間更短。外泌體 NSMase-1通過外泌體分泌降低體外SM/Cer 比率從而抑制HCC細胞生長并誘導細胞凋亡，表明NSMase-1 在抗 HCC 藥物研發應用方面具有巨大的潛力，并可作為 HCC 患者的潛在預后生物標志物。NSMase-2為HCC的腫瘤抑制因子，NSMase-2 的過表達使 HCC 細胞系中的細胞增殖降低50%；相反，敲低NSMase-2 可促進體外細胞侵襲和遷移，并增加體內腫瘤形成[35-36]。此外，NSMase-2表達下調會抑制 TNFα介導的單核細胞/巨噬細胞的炎癥反應，減少IL-1β、單核細胞趨化因子等炎性細胞因子的分泌[37-38]，并參與多種炎癥疾病的發生發展。

3.2 ASMase在HCC中的作用 ASMase受紫外線照射、腫瘤壞死因子、氧化應激和抗癌藥物等多種外源性刺激能迅速活化[39-40]，并由細胞內移位到胞膜上水解膜上SM生成Cer和磷酰膽堿。研究[41-42]表明，缺乏ASMase的細胞或小鼠能夠抵抗抗腫瘤刺激誘導的細胞凋亡，而過表達 ASMase 會增加癌細胞對化療和放療的敏感性，表明ASMase是抗癌治療的一個潛在靶點。

SL和 SMases通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路和自噬的相互作用介導參與HCC 的發病機制。mTOR是調節腫瘤細胞增殖、代謝和生存的必要復合物之一，其組裝成兩個不同的復合物：mTORC1和mTORC2[43]。Xu等[44]研究表明，mTORC2/Akt1(蛋白激酶1) 級聯反應在原癌基因 c-Myc 誘導小鼠和人類HCC發生發展中至關重要， mTORC2通路的表達上調可以通過刺激脂肪酸和脂類的從頭合成途徑，從而誘導脂肪變性和HCC的發生發展。雖然自噬是一種為能量生成提供營養物質以維持關鍵細胞功能的機制，但自噬在HCC中似乎起著自相矛盾的作用。已有研究[45]證明，自噬可以保護癌細胞免受受損細胞器和蛋白質聚集的堆積，防止細胞死亡和癌癥治療的毒性。此外，通過藥物或腺病毒小干擾RNA介導的自噬抑制可使HCC細胞對多激酶抑制劑 Linifanib 敏感[46]。然而，自噬標志物的減少與更具侵襲性的HCC的發病機制和進展相關，Beclin-1和Bax在HCC組織中的表達可能對抑制 HCC 增殖、浸潤、轉移和血管生成提供協同作用[47]。研究[48]表明，在影響自噬的藥物中，伏立諾他和索拉非尼可通過ASMase/Cer依賴途徑增加ERS與自噬來促進HCC癌細胞凋亡。此外，重組人ASMase作為索拉非尼治療 HCC 的潛在輔助治療制劑，重組人ASMase聯合索拉非尼在減少Huh7異種移植物中的腫瘤體積、促進腫瘤細胞壞死以及降低血管密度方面表現出協同作用，并且其安全性和耐受性良好[49]。因此，ASMase具有作為HCC潛在療法的靶向性。

4 小結與展望

綜上所述，SMase作為一種新型的潛在治療靶點，其在細胞凋亡和增殖、細胞周期停滯、細胞遷移和炎癥等生物學過程中的確切作用已得以闡述，并與HCC的發生和發展密切相關。但仍存在以下不足之處：(1)SMase在HCC中的具體分子機制仍未完全明晰且大多研究仍停留于實驗研究階段，距離疾病的臨床評估和藥物開發等實際應用還有一定的差距；(2)目前，SMase在HCC中研究多集中于NSMase 和 ASMase，而Alk-SMase對HCC發生發展的相關研究鮮有報道；(3)SMase對HCC非癌細胞的影響尚不明確。因此，未來急需進一步深化基礎研究，尤其是Alk-SMase對HCC發生機制的確切作用，并開展臨床應用驗證，更加細化的深入探索SMase在HCC不同階段、不同細胞中的作用和機制。相信隨著SMase對HCC研究和認識的深入，SMase有望成為HCC新型的預測因子和藥物治療靶標，為HCC的早期診斷、靶向治療及預后評估等方面提供新策略。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：姚春、張廣發負責擬定寫作思路，撰寫文章；毛德文負責研究選題，指導文章撰寫和修改；張榮臻、劉茵負責設計論文框架；樂瀅玉負責起草論文。