膽道菌群導致原發性肝內膽管結石形成機理的研究進展

任江平， 邱錦飛， 鄒 楊， 蔡曉蓓， 徐承雷， 李 江

昆明醫科大學第一附屬醫院 肝膽外科， 昆明 650032

原發性肝內膽管結石(primary intrahepatic stones, PIS)一般是指結石在左、右肝管匯合處近端的肝內膽管發生，但不包括從膽囊內排出并進入肝內膽管的結石，也不包括繼發于損傷性膽管狹窄、膽管囊腫、膽管解剖變異等其他膽道疾病所致的肝膽管結石[1-2]。肝內膽管結石的成分主要是棕色膽色素結石。日本學者[3]進行一項持續40余年共7次流行病學調查，研究結果顯示肝膽管結石主要是膽色素結石，膽固醇結石所占比例較小，為5.7%～13.1%。在中國、日本等許多亞洲國家肝內膽管結石均為常見疾病。我國肝內膽管結石年發病率為2%～2.5%[4]，主要集中在長江流域地區、東南沿海和西南的小部分地區。盡管近年來手術切除率顯著提升，但因PIS病情遷延、復雜，治療后復發率高。近期有研究[5-6]報道，肝內膽管結石經過初始治療后，結石的殘留和復發率依然較高，這使得部分患者不得不再次或多次手術，術后仍然反復復發，導致門靜脈高壓癥、膽汁性肝硬變和肝內膽管局部惡變等[7]。因此，了解PIS的病因和發病機制，才能更合理地選擇防治策略[8]。PIS在病理學上表現為含有結石的肝內膽管上皮慢性炎癥，膽管周圍腺體增生和壁纖維化的特點[9]。過去有觀點[10]認為結石的發生主要與膽道感染和膽道梗阻導致的膽汁淤積有關。隨著進一步的研究發現存在著更多復雜因素，如膽道細菌的存在、腸道菌群失衡、寄生蟲感染后的持續免疫反應、代謝缺陷、飲食習慣、環境改變和遺傳等。這些因素均會干擾肝內膽管的膽汁成分和膽道流體力學改變，導致結石的形成。

細菌感染仍是PIS的關鍵因素之一，且被越來越多的研究證實。本文擬探討細菌引起PIS的相關機理，為肝內膽管結石的治療及術后復發預防提供參考。

1 細菌感染與PIS

1.1 PIS的細菌學檢測手段 以往國內外均將正常的膽道視為一個無菌性環境[11]。近年來，隨著對膽道微生態研究的深入，健康膽道無菌的觀點遭受了挑戰。Jiménez等[12]在健康豬的膽道中檢測出細菌存在。之后Molinero等[13]首次在沒有任何肝膽疾病個體的膽汁中檢測到細菌群落。因此認為正常膽道或許存在一個微生態系統，若有膽道疾病致病因素存在，該微生態系統的平衡就會失調，如優勢菌群變化、菌群多樣性降低、微生物代謝改變等，從而引起結石發生。細菌和肝內膽管結石形成之間有著密切的聯系。Tabata等[14]早在20世紀80年代研究發現，美國肝內膽管結石患者并發膽道感染的發生率高達96.3%，這在當時與日本、中國及其他東亞國家的報告相一致。以往通常使用培養基進行需氧和厭氧菌培養，或者應用PCR的方法鑒別出細菌。近年來，新一代高通量測序技術的出現打破了傳統方法，可以從分子生物學角度研究微生物群體的所有DNA或RNA，對微生物群體的結構多樣性及功能多樣性有了更多的了解[15]。

1.2 PIS的細菌譜 有文獻[16]報道20世紀50年代侯寶璋就提出細菌感染可能會導致肝內膽管結石，但其未進行后續研究。隨著檢測手段的逐漸成熟，國內外對PIS患者細菌譜的認識也在不斷深入(表1)。

表1 肝內膽管結石菌群的相關研究結果

各研究報道的膽道菌群多樣性及群譜并非完全一致，可能與檢測手段、檢測樣本數量差異有關。較具有代表性的為2002年Chang等[19]對過去10年共1394例膽道感染患者的細菌譜進行了分析，其中肝內結石患者的膽汁細菌陽性培養率為67%，細菌譜以革蘭陰性菌(74%)為主，主要為大腸桿菌(36%)、克雷伯氏菌(15%)，有少量的革蘭陽性菌(15%)，如腸球菌(6%)、葡萄球菌等；極少量的厭氧菌也被發現，如類桿菌和梭菌。另有報道[25-26]肝內膽管結石患者膽汁及膽管黏膜中存在幽門螺桿菌感染。總體上，PIS膽道感染的細菌譜在國內外近30年來無較大變化，需氧菌中大腸桿菌、克雷伯氏菌、腸球菌、腸桿菌較為常見，而厭氧菌以梭菌和類桿菌較常見，一般厭氧菌都是伴隨著需氧菌存在。現將肝內膽管結石細菌培養的細菌譜占比歸納如下(表2)。

表2 肝內膽管結石膽汁或結石細菌譜

由此可以發現，膽道菌群與腸道菌群譜有大量重合。上文中提到有研究者發現肝內膽管結石患者膽道系統中存在幽門螺桿菌感染也證實了膽道菌群和腸道菌群可能是相互聯系的。本中心曾于2014年對膽囊結石患者的膽道核心菌群進行了鑒定和分析[27]，以膽囊結石患者的膽結石、膽汁及糞便的菌群為研究對象，結果顯示膽道菌群與腸道菌群譜有大量重合，并探討了膽道菌群和腸道菌群變化與膽結石形成的關系，從而對肝膽管結石的初始外科治療更加規范[28]。然而，關于膽道菌群的來源至今還沒有定論，目前普遍認為是腸道微生物群逆行感染的重要通路。細菌通過Oddi括約肌入侵膽道導致感染，這被認為是最主要因素[29]。此外，有學者認為細菌通過門靜脈入侵也是膽道感染的途徑之一。

2 細菌在PIS發病中的可能致病機制

膽道細菌在人類色素性膽結石的發病機理和形成中發揮重要作用[30-31]，與膽囊結石、膽總管結石一樣，PIS絕大部分為色素性結石，在這些患者的膽汁樣本中細菌的16S rRNA檢出率很高[32]。著名的Maki學說[10]闡述了膽道感染與結石具有密切關系，并指出感染膽汁中細菌產生的大量β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase, β-G)在結石形成過程中具有著重要的作用。具體機制如下：β-G能水解結合膽紅素(conjugatebilirubin, CB)，將其分解為葡萄糖醛酸和非結合膽紅素(unconjugatebilirubin, UCB)，而后UCB與鈣離子相結合形成膽紅素鈣。目前已有大量研究發現許多菌群能通過β-G途徑參與PIS形成，可產生β-G的細菌主要為大腸桿菌，其次為部分厭氧菌，如脆弱類桿菌和梭形桿菌等，少數其他需氧菌(如幽門螺桿菌等)、兼性需氧菌也可產生。這種由膽道感染細菌產生的β-G，稱為細菌性β-G或者外源性β-G；另一種β-G由肝細胞、肝內膽管上皮細胞(intrahepatic bile duct epithelial cell，HIBEC)產生，稱為組織性β-G或者內源性β-G，當組織破壞和細胞解體時被釋放。隨著對內、外源性β-G與PIS之間關系的深入研究，發現組織性β-G與色素性結石形成關系更為密切[33]。此外，PIS細菌培養陽性率很高，但仍有極少部分的標本中并未檢測到細菌，提示可能是患者組織性β-G發揮作用。下面將現階段國內外對菌群與PIS關系的研究進行總結并繪制機制圖(圖1)。

內源性β-G可將CB分解，在促進膽色素結石形成過程中起重要作用。其機制可能與革蘭陰性桿菌產生的內毒素有關，內毒素引起炎癥反應，導致膽管上皮細胞損傷和內源性β-G分泌增多，從而促進結石形成[34](圖1途徑1)。

隨著對肝內膽管結石發病機制的深入研究，發現膽管周圍存在腺體組織，這是肝內膽管結石典型的病理特征，腺體的黏液腺泡均含有豐富的中性、羧化和硫酸化黏液糖蛋白。2013年Yang等[35]發現含結石的HIBEC因炎癥刺激分泌的黏蛋白明顯高于正常膽管，黏蛋白分子在肝內膽管黏膜表面形成一層膠體凝膠，充滿膽管腔內，可造成膽汁淤滯和機械性膽道梗阻，從而為結石的形成提供條件。其內主要包括唾液酸蛋白和硫黏蛋白等酸性物質[36]，酸性物質會使膽汁環境的pH值降低，導致膽紅素鈣和UCB的溶解度明顯下降，從而析出結晶導致結石形成，酸性環境亦利于有些細菌如幽門螺桿菌等生長，從而繼發細菌感染。此外，過多的唾液酸蛋白、硫黏蛋白等分子分泌后可能會在肝內膽管黏膜表面形成一個特殊的微環境，該微環境是一個網狀結構，脫落的細菌、細胞上皮和膽汁中的鈣鹽脂質等物質容易鑲嵌在其中，從而聚集導致結石形成、復發。PIS與膽管狹窄之間存在惡性循環，結石本身及其繼發的膽道感染均可刺激膽管壁持續增生，導致CPC和膽管狹窄的發生，CPC的反復發作反過來會產生大量的黏蛋白促進新結石的形成，或者誘導膽管狹窄和膽汁淤積[37](圖1途徑2)。

注：LPS，脂多糖；CPC，慢性增殖性膽管炎；Cag A，細胞毒素相關蛋白；Vac A，細胞空泡毒素。

此外，大部分細菌如大腸桿菌、克雷伯氏菌等均會產生磷脂酶A1，可將膽道磷脂酰膽堿分解為游離脂肪酸和溶血磷脂酰膽堿，因其具有疏水性，一方面會使脂肪酸鈣快速沉積，另一方面會使HIBEC分泌大量的黏蛋白，進而導致結石形成(圖1途徑3)。

正常情況下，膽囊內壁作為黏膜屏障，具有預防膽囊結石形成、維持正常生理功能等作用。膽囊結石患者的膽囊內壁被破壞了局部的黏膜屏障[38]，同時會繼發其他細菌感染，細菌產生的外源性β-G大量分泌有利于結石的形成。由于膽囊黏膜和肝內膽管上皮的相似性，可推測肝內膽管黏膜屏障受到破壞可能存在相似途徑促進結石形成(圖1途徑4)。

膽道與十二指腸菌群之間具有一定的相似性和關聯性[39]。幽門螺桿菌在較低濃度的膽汁酸中存活，通過十二指腸后依然能夠定植、生長。2007年李霆等[40]發現幽門螺桿菌不僅與大腸桿菌等其他細菌一樣能通過內源性β-G途徑參與PIS的形成，也能通過自身產生的相關代謝產物導致結石形成。2006年包文中[25]通過對PIS患者膽汁及膽管黏膜進行檢測，證實了幽門螺桿菌和幽門螺桿菌感染相關蛋白存在：在膽汁中檢測出Cag A、Vac A、尿素酶A及尿素酶B等多種細菌產物。除了幽門螺桿菌，大腸桿菌等細菌也能分泌大量Cag A、Vac A等代謝產物，在PIS患者體內可作為一種促成核因子導致結石形成和復發，但其具體致病機理目前暫無進一步研究(圖1途徑5)。

2000年曾勇等[41]對比膽汁、血清和膽囊免疫球蛋白分泌細胞在成石過程模型中的變化，證實膽汁免疫球蛋白含量與細菌感染密切相關。正常情況下膽管處于“防御”和“損傷”的動態平衡，即成核和抗成核蛋白共存,通常抗成核占優勢地位，被膽道細菌感染后這一動態平衡被打破，具體機制可能是膽管內水分吸收障礙，導致蛋白質濃度升高；此外，大量分泌細胞生長后，一方面會導致強烈的炎癥反應，損害膽管黏膜，另一方面成核蛋白增加，為結石的形成創造了良好的條件(圖1途徑6)。

在PIS患者中，膽道細菌感染后會產生大量的UCB，與鈣離子結合從而形成膽色素結石。研究[42]表明，膽汁酸一定水平上能防止膽色素結石形成，具體機制可能是在膽汁中的其酸性能增加膽紅素鈣溶解度。但有學者[10]通過對肝內膽紅素結石與膽總管結石的膽汁成分分析比較發現：肝內結石總膽汁酸水平比膽總管結石低，其細菌代謝產物結合膽汁酸(如甘氨膽酸、牛磺膽酸)含量較高，說明當膽汁酸成分改變或鈣離子/UCB水平增加，會導致膽管內膽紅素鈣溶解度下降，從而形成結石(圖1途徑7)。

有研究[43-45]證實，β-G的上調可能與LPS的代謝有關。LPS是一種內毒素，位于革蘭陰性桿菌細胞壁的最外層。2007年孫韶龍等[43]發現LPS可以增加小鼠肝臟細胞β-G mRNA的表達，從而參與膽色素結石的發病。目前認為可能的機制是膽道感染菌群產生LPS后，與脂多糖結合蛋白(LBP)結合形成LPS-LBP復合物，然后與肝細胞、外周血單核細胞膜表面的CD14相結合，從而能夠被CD14轉運到細胞膜上的Toll樣受體4(Toll like receptor 4, TLR4)，以實現跨膜傳導。當LPS與TLR4結合后通過一系列的信號級聯反應，激活核因子-κB(NF-κB)，活化的NF-κB可以穿梭核膜進入核內，最終細胞內控制β-G的基因(GUSB基因)被啟動，從而轉錄大量的mRNA，合成更多的β-G蛋白。以上從分子水平上闡述了LPS通過相關途徑合成和釋放大量的內源性β-G。LPS也可激活HIBEC的TLR4/NF-κB/c-myc信號通路H和PKC/NF-κB/c-myc信號通路實現內源性β-G大量表達[44-45]。

迄今為止，相關研究已檢測出20多種黏蛋白，分布于機體各個器官，肝內主要含6種黏蛋白，分別為MUC1、MUC2、MUC3、MUC5AB、MUC5AC以及MUC6[46-47]，由肝內膽管黏膜及周圍腺體分泌，PIS患者膽管分泌的上述黏蛋白較正常肝內膽管多。LPS刺激黏蛋白MUC2、MUC5AC上調的研究主要集中于呼吸道，其機制可能是LPS通過與TLR4結合從而轉錄和翻譯多種致炎因子，例如TNFα、IL-6等，從而誘導MUC5AC表達。Shen等[48]將呼吸道上皮細胞暴露于LPS后，量化了SPC-A1(一種人呼吸道黏膜下腺細胞系)中MUC5AC表達水平的變化，導致MUC5AC表達增加(EGFR-p38/JNK信號傳導通路)。由于呼吸道上皮和肝內膽管上皮在胚胎學具有同源性，可推測LPS誘導肝內膽管分泌黏蛋白增多可能存在相似途徑。此外，一些信號通路也為藥物靶點治療PIS提供了潛在的新策略。如LPS可通過多種分子途徑刺激MUC5AC過表達[49]，p38絲裂原活化蛋白激酶MAPK(p38MAPK)通路參加了PIS的形成過程[50](圖2)。

圖2 LPS誘導結石形成可能的機制

以上探討了促結石形成的機理，與之作用相反的，部分桿菌菌株具有膽汁鹽水解酶活性，能夠阻止肝膽管結石的形成[51]。國外研究[52]發現部分膽道細菌產生的膽鹽解離和多重耐藥外排泵蛋白均與細菌的膽汁耐受有關。2016年葉福強[53]對膽總管結石的膽汁樣本進行宏基因組學分析，發現膽汁細菌中有13個菌種能夠編碼膽鹽水解酶，30個菌種能夠編碼外排泵蛋白，但目前暫無研究報道PIS也有類似機制。此外，中間普雷沃菌和糞腸球菌產生的細菌黏液和生物膜，在膽汁耐受中也發揮重要作用[54]。

3 小結

綜上所述，致石菌群對于PIS的形成過程，無論是致病菌的多樣性，還是發病機制的復雜性，均表明了其舉足輕重的地位。通過對PIS細菌譜的研究，可以為抗感染等相關用藥治療提供依據；而對于致石菌群導致PIS發病機制的認識，可以幫助從根源上防治肝膽管結石形成或復發，從而尋找更有效的臨床治療方法。然而，膽道菌群感染被認為是肝內膽管結石形成的一個極為重要的因素，但并非獨立且唯一的因素，因其復雜性目前國內外學者尚未達成共識，因此，探索肝內各級膽管節段性和區域性分布的菌群，以及其代謝和微環境的相互影響有助于進一步探討PIS形成機制，從而對該領域進行多中心、多學科、多角度、多層次的研究，以便對該病的治療產生積極的影響。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：任江平、邱錦飛、李江負責課題設計，資料分析，撰寫論文；鄒楊、蔡曉蓓、徐承雷、李江參與收集數據，修改論文；李江負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。