TXNRD1在肝細胞癌中活性氧相關細胞凋亡導致多藥耐藥性中的作用

李大志， 黃俊杰， 鄭樹森， 章愛斌

浙江大學醫學院第一附屬醫院 a.多器官聯合移植重點實驗室， b.肝膽外科， 杭州 310000

肝細胞癌(HCC)在世界各地有著很高的發病率和死亡率，特別是在亞洲、非洲和南歐。目前，HCC已經成為全球第五大常見癌癥和第三大癌癥死亡原因[1]。在我國，HCC的發病率和死亡率分別排在第四位和第二位，且HCC患者預后在臨床上仍不盡如人意[2]。對于那些無法手術的患者而言，化學藥物治療的效果常受到藥物耐藥性的限制，特別是多重耐藥性(multi-drug resistance，MDR)[3]。

MDR的發生和發展是一個涉及多種因素的極其復雜的過程。先前研究[4]證實上皮/間質轉化、ABC轉運蛋白家族的表達、DNA損傷修復和藥物外排蛋白的過度表達都與MDR密切相關。代謝扭曲和過度復制引起的過度氧化應激是癌細胞的共同特征[5]。目前，代謝重編程也被認為是癌癥的標志。細胞信號通路的異常激活使癌細胞面臨更大的氧化應激壓力。隨著細胞活性氧(ROS)蓄積，癌細胞只有增加抗氧化能力，才能對抗ROS誘導的細胞調亡[6]。硫氧還蛋白(TXN)、硫氧還蛋白還原酶(TXNRD)和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)構成細胞內硫氧還蛋白系統(Trx)，該系統對還原-氧化 (氧化還原) 穩態至關重要。TXNRD是一種含硒酶和NADPH依賴性黃素蛋白，可將氧化的TXN還原為其二硫醇形式以維持細胞氧化還原穩態[7]。NF-E2相關因子2 (Nrf2) 是一種重要的核轉錄因子，通過Nrf2/ARE通路調節包括TXNRD1 在內的眾多細胞保護基因的表達[8]。有趣的是，在各種實體癌如HCC[9]、結腸直腸癌[10]、前列腺癌[11]中, Trx常常被激活并且TXNRD1過表達。此外，TXNRD1 可以作為HCC患者的預后因素[12]。

相關臨床研究[13]也證實，癌細胞清除ROS的能力是癌癥患者預后的指標之一。臨床樣本TXNRD1表達的增加與晚期臨床分期和較差的患者存活率呈正相關。化療藥物通過破壞靶細胞中的氧化還原穩態，進一步導致細胞死亡以達到治療效果。可以推測TXNRD1表達高的病例更有可能對化療藥物產生抗藥性。TXNRD1抑制劑——金諾芬(AUR)，由于其眾所周知的安全毒性特征，該化合物被批準用于治療類風濕關節炎。目前，AUR對于其他疾病(包括癌癥、神經退行性疾病)的潛在治療價值也在探索中[14]。

本研究擬通過siRNA敲低或AUR藥物抑制TXNRD1的活性，探究TXNRD1在藥物耐藥性中發揮的作用，并通過N-乙酰半胱氨酸(NAC)進行ROS耗竭來探索ROS介導耐藥性的可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系和轉染 人HCC細胞系BEL/FU和親本細胞系BEL-7402購買于KeyGen Biotech Co., Ltd.(中國南京)。 BEL/FU細胞和BEL-7402細胞在含有10% FBS(BI, 以色列)的 RPMI-1640(BI，以色列)培養基中于5% CO2和37 ℃下培養。在具有50%細胞密度的 6孔板中進行轉染。Lipofectamine 3000試劑(Thermo Scientific，美國)和Opti-MEM根據制造商的說明使用siRNA轉染細胞。TXNRD1si-1上游引物：GCAAGACUCUGAAAUUUTT； TXNRD1si-1下游引物：AUAAUUUCGAGAGUCUUGCTT； TXNRD1si-2上游引物：GGA AGAACAUGGCAUCAAGUUTT； TXNRD1si-2下游引物：AACUUGAUGCCAUGUUCUUCCTT。然后，收集細胞用于基因表達測定。

1.2 集落形成試驗 通過在6孔板中接種BEL/FU細胞進行集落形成試驗。用5-氟尿嘧啶(5-Fu)、多柔比星(DOX)和AUR處理48 h后，將細胞在新鮮培養基中培養14 d。然后，將菌落用結晶紫染色進行計數。

1.3 藥物細胞毒性和細胞增殖試驗 化療藥物的細胞毒性由CCK-8法測定，計算藥物半抑制濃度(IC50值)，觀察藥物的細胞毒性。為了評估細胞增殖，將BEL/FU細胞(2×103個/孔)置于96孔板中，并在0、24、48、72和96 h通過CCK-8試劑(DOJINDO Laboratories，日本)檢測，操作依據試劑的操作說明。

1.4 蛋白質印跡 RIPA緩沖液(Thermo Scientific，美國)和BCA 蛋白質檢測試劑盒(Thermo Scientific，美國)用于檢測蛋白質濃度。將30 μg蛋白質加載到4%～20% SDS-PAGE(Life Technology，USA)上進行分離，然后轉移到0.2 μm PVDF膜(Millipore，USA)上， 5%脫脂牛奶封閉2 h后，將膜與適當的一抗 (1∶1000) 在4 °C下孵育過夜。隨后，將條帶洗滌并與相應的HRP偶聯二抗 (1∶5000) 一起孵育。通過 EZ-ECL(Biological Industries, 以色列) 檢測蛋白質表達。使用Image Lab軟件分析條帶密度以量化蛋白質量。

1.5 ROS檢測 收獲細胞并用PBS洗滌。然后，將細胞重新懸浮在PBS中，并與2 μL CellROX Green Reagent(Thermo Scientific，美國)共孵育30 min。通過流式細胞術測量細胞內ROS水平，結果以熒光強度表示。

1.6 RNA分離和實時定量PCR(RT-PCR) 使用TRIzol試劑(Invitrogen)從細胞系中提取總RNA。 PrimeScript RT-PCR試劑盒(TaKaRa Biotechnology，中國)用于逆轉錄。 SYBR Green PCR 試劑(TaKaRa)用于使用Bio-Rad PCR儀器(CA，美國)進行RT-PCR。所用引物見表1。

表1 引物序列

1.7 異種腫瘤移植模型測定 為了探究TXNRD1在體內耐藥機制中發揮的作用，從杭州子源實驗動物科技有限公司購買了4周大的免疫缺陷裸鼠[許可證：SCXK(浙)2019-0004]構建了異種腫瘤移植模型。將5×106個BEL/FU細胞皮下接種到每只小鼠的右脅腹中。 接種3 d后，小鼠接受藥物治療。腫瘤體積的計算公式為：體積=(長×寬×寬)/2。當腫瘤體積大于2000 mm3或者達到觀察終點時，處死小鼠。

1.8 倫理學審查 研究中的所有動物實驗程序均獲得浙江大學醫學院第一附屬醫院實驗動物倫理委員會的批準，批號：(2020)實動快審第(7-1)號。

1.9 統計學方法 使用SPSS 21.0軟件進行統計分析。計量資料兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TXNRD1在HCC組織和多重耐藥細胞系BEL/FU中的表達情況 通過癌癥基因組圖譜(TCGA)數據集分析證實 TXNRD1在癌組織中高表達，與正常肝組織相比，HCC組織中TXNRD1的mRNA水平顯著上調(P<0.001)(圖1a)。病理分級Ⅲ、Ⅳ級患者的TXNRD1表達水平高于病理分級Ⅰ、Ⅱ級的患者(P=0.006)(圖1b)。與正常細胞系LO2相比，HCC細胞系的TXNRD1在mRNA水平均明顯上調(P值均<0.01)(圖1c)，蛋白表達水平與mRNA表達趨勢一致(P值均<0.05)(圖 1e)。BEL/FU細胞系和BEL-7402細胞系中5-Fu和DOX的IC50值具有明顯差異(P值均<0.001)(圖1f、g)。BEL/FU細胞中的TXNRD1較親本BEL-7402細胞在mRNA水平上調(P=0.004)(圖1d)，蛋白表達水平與mRNA表達趨勢一致(P<0.05)(圖1h)。蛋白免疫印跡結果顯示，BEL/FU細胞系中的Nrf2水平較親本BEL-7402細胞系在胞質蛋白中無明顯差異(P=0.693)，而胞核蛋白中水平較高(P<0.05)(圖1i)。

2.2 TXNRD1抑制使BEL/FU細胞對5-Fu和DOX敏感 為了探究TXRND1的功能，利用 siRNA沉默TXNRD1在BEL/FU細胞中的表達。在設計的siRNA中，TXNRD1-1 (si-1#) 和TXNRD1-2 (si-2#) 在抑制TXNRD1表達方面最有效，且可特異性敲低TXNRD1的mRNA水平(P值均<0.001)，而不影響TXNRD2和TXNRD3的mRNA水平(P值均>0.05)(圖2a)。對不同細胞系中TXNRD1蛋白的表達進行檢測，結果也證實了si-1#和si-2#明顯抑制了TXNRD1蛋白的表達(P值均<0.05)(圖2b)。si-1#和si-2#細胞在5-Fu (1000 μmol/mL)和DOX(5 μmol/mL)干預下，細胞活力顯著低于si-Ctrl(P值均<0.05)(圖2c、d)。在5-Fu (1000 μmol/mL)和DOX(5 μmol/mL)的處理下，si-1#和si-2#細胞克隆形成均較si-Ctrl明顯減少(DOX：P值均<0.001；5-Fu：P值分別為0.043、0.015)(圖2e)。

注：a，正常肝組織和HCC組織中TXNRD1的mRNA水平(TCGA數據集)； b，不同病理分級患者的TXNRD1表達水平；c，正常肝細胞LO2和HCC細胞中TXNRD1的mRNA水平；d，BEL/FU和BEL-7402細胞系中TXNRD1的mRNA水平；e，HCC細胞系和LO2中TXNRD1的蛋白質水平；f、g，BEL/FU和BEL-7402細胞系中5-Fu、DOX的IC50值；h，BEL/FU和BEL-7402細胞系中TXNRD 1的蛋白水平；i，BEL/FU和BEL-7402細胞系中的Nrf2表達水平。CP，細胞質蛋白，NP,核蛋白。

2.3 siRNA敲低TXNRD1通過破壞細胞內氧化還原穩態重塑藥物敏感性 ROS抑制劑NAC是常用的ROS清除劑。經體外流式細胞術檢測，si-1#和si-2#細胞的ROS水平較si-Ctrl明顯升高(P值均<0.001)，經過NAC (0.5 mmol/L)處理24 h后，細胞的ROS水平均有所下降(P值均<0.001)(圖3a)。當BEL/FU細胞中的TXNRD1被si-1#和si-2#敲低時，經5-Fu(1000 μmol/mL)作用24 h后，細胞凋亡比例明顯增加(P值均<0.001)；同期進行NAC(0.5 mmol/L)干預，可以降低BEL/FU細胞凋亡比例(P值均<0.001)(圖3b)。經DOX (5 μmol/mL)作用24 h后，細胞凋亡比例明顯增加(P值均<0.001)；同期進行NAC(0.5 mmol/L)干預，可以降低BEL/FU細胞凋亡比例(P值均<0.001)(圖3c)。蛋白免疫印跡結果證實，si-Ctrl細胞內Caspase-3、Survivin蛋白的表達水平及Bcl-2 /Bax比率均較BEL/7402細胞、si-1#和si-2#細胞升高(P值均<0.05)(圖4)。

注：a，BEL/FU細胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#中TXNRD1、TXNRD2、TXNRD3的mRNA水平；b，BEL/FU細胞系未處理組、si-Ctrl、si-1#、si-2#中TXNRD1的蛋白質水平；c、d，BEL/FU細胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#應用DOX、5-Fu藥物后的OD450 nm吸光度曲線；e，BEL/FU細胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#應用DOX、5-Fu藥物后的細胞克隆集落形成。

注：a，BEL/FU細胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#、si-1#+NAC、si-2#+NAC細胞內ROS含量； b，BEL/FU細胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#應用5-Fu或5-Fu聯合NAC后細胞凋亡比例；c，BEL/FU細胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#應用DOX或DOX聯合NAC后細胞凋亡比例。

圖4 BEL/7402和BEL/FU細胞系中細胞凋亡相關的蛋白質表達

2.4 AUR是BEL/FU細胞的有效藥物增敏劑 AUR對TXNRD1具有抑制作用。BEL/FU細胞和BEL-7402細胞對AUR的藥物敏感性(IC50值)差異無統計學意義(P=0.153)(圖5a)。經AUR (0.3 μmol/L) 處理后BEL/FU細胞系中5-Fu與DOX的IC50值明顯下降(P值均<0.01)(圖5b、c)。BEL/FU細胞在AUR(0.3 μmol/L)與5-Fu(1000 μmol/mL)不同分組處理條件下細胞活力變化如圖所示(圖5d)。在AUR(0.3 μmol/L)聯合DOX(5 μmol/mL)處理組細胞克隆形成較DMSO、DOX(5 μmol/ml)組明顯減少(P值均<0.001)(圖5e)；在AUR(0.3 μmol/L)聯合5-Fu(1000 μmol/mL)處理組細胞克隆形成較DMSO、5-Fu組(1000 μmol/mL)明顯減少(P值均<0.001)(圖5f)。相同濃度下BEL /FU細胞經AUR聯合5-Fu處理后細胞凋亡比例較5-Fu處理組明顯升高(P<0.001)，AUR聯合DOX較DOX處理組也明顯升高(P<0.001)(圖6、7)。

注：a，BEL/7402、BEL/FU細胞系對藥物AUR的IC50； b，BEL/FU細胞系在應用AUR前后對5-Fu的IC50；c，BEL/FU細胞系在應用AUR前后對DOX的IC50；d，BEL/FU細胞系在應用DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu藥物后的OD450 nm吸光度曲線；e，BEL/FU細胞系在應用DMSO、DMSO+DOX、DMSO+AUR、AUR+DOX藥物后的細胞克隆集落形成；f，BEL/FU細胞系在應用DMSO、DMSO+5-Fu、DMSO+AUR、AUR+5-Fu藥物后的細胞克隆集落形成。

圖7 不同分組BEL/FU細胞的調亡比例比較

2.5 AUR可有效改善BEL/FU細胞體內5-Fu耐藥性 通過將BEL/FU細胞接種在免疫缺陷小鼠的皮下，構建異種移植模型，對AUR的體內治療效果進行評估。用DMSO、AUR(6 mg·kg-1·d-1，皮下注射)、5-Fu(25 mg·kg-1·d-1，皮下注射)或藥物聯合處理對接種BEL/FU細胞的異種移植物小鼠進行分組并進行處理觀察9 d。不同分組在觀察終點的腫瘤大小如圖8a所示，不同分組的腫瘤生長曲線如圖8b所示。觀察終點時，AUR處理組與DMAO處理組相比，腫瘤治療無統計學差異(P=0.063)，AUR聯合5-Fu組較單一5-Fu處理組抑制腫瘤生長的能力明顯提升(P<0.001)(圖8c)。觀察終點時，AUR聯合5-Fu組較單一5-Fu處理組腫瘤質量明顯縮小(P<0.001)(圖8d)。觀察期間各組小鼠體質量變化曲線如圖8e所示。

3 討論

感染、紫外線、煙草、酒精等外界因素的干擾會導致細胞內ROS水平升高，而這些因素亦是導致癌癥的因素。以往的研究[15]表明，癌癥的發生、進展、血管生成和轉移與ROS密切相關。由于癌細胞的代謝活性增強和信號通路的異常激活，使它們具有比正常細胞更高的基礎ROS水平[16]。因此，癌細胞需要更完善和可靠的ROS消耗途徑來應對由細胞內較高ROS水平引起的氧化應激，以避免細胞凋亡[17]。更重要的是，傳統的抗腫瘤藥物和放療作為經典的抗腫瘤方法會增加癌細胞中的ROS水平。這些干預措施會導致DNA損傷、細胞周期停滯甚至細胞凋亡，但癌細胞強大的抗氧化系統可以保持細胞內氧化還原穩態，因此這些治療措施難以達到理想的效果。

5-Fu與DOX作為臨床化療藥物的常見選擇，耐藥現象的出現往往使化療不能取得理想的治療效果。筆者先前的研究[18-19]也證實，源自BEL-7402細胞系的BEL/FU細胞對5-Fu和DOX具有穩定的耐藥性，為了研究耐藥相關的分子機制，筆者選取了實驗室保存的肝癌細胞BEL-7402的5-Fu與DOX多重耐藥株BEL/FU細胞，并發現TXNRD1在BEL/FU細胞中表達升高；通過siRNA下調TXNRD1蛋白的表達水平后，BEL/FU細胞對藥物5-Fu與DOX的敏感性明顯增加。結合先前研究結果，筆者認為在肝癌細胞中TXNRD1表達上調可能通過增強DNA的損傷修復能力從而增加了細胞對藥物5-Fu與DOX的耐受性；而TXNRD1的抑制則干擾了dNTPs庫，從而干預了DNA的損傷修復，或者通過 Bcl-2/Caspase信號通路誘導細胞凋亡，從而增強了細胞對藥物的敏感性。

注：a，經DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu處理后，BEL/FU成瘤大體圖片； b，經DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu處理后，BEL/FU腫瘤體積變化曲線；c，經5-Fu、AUR+5-Fu處理后，BEL/FU腫瘤觀察終點時體積； d，經DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu處理后，BEL/FU腫瘤觀察終點時質量；e，經DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu處理后，裸鼠體質量變化曲線。

AUR是一種臨床上用于治療風濕性關節炎的藥物，能夠有效抑制TXNRD1的活性。許多研究表明AUR在癌癥治療中具有良好的耐受性和安全性。單獨干預TXNRD1和/或與傳統的抗腫瘤方法(藥物治療、放療等)結合來干擾癌細胞中氧化還原穩態是一個可行的策略。這一發現不僅見于實體瘤，如乳腺癌[20]、肝癌[21]，也見于血液系統腫瘤[22]。本研究結果證實TXNRD1是干預耐藥癌細胞氧化還原穩態的合適靶點，這為對化療藥物耐藥的患者提供了一個新的選擇。TXNRD1表達水平與HCC預后之間的密切關系表明它可作為治療靶點[23]。此外，癌細胞的基礎 ROS水平高于正常細胞，使它們更容易受到這種干預。此外，TXNRD1的肝細胞特異性敲除不影響肝臟生長和再生率[24]，即AUR作為 TXNRD1抑制劑不影響肝臟正常功能，而是選擇性靶向癌細胞。

抗氧化劑廣泛存在于食用的各種飲食原材料中。但每天攝入的抗氧化劑如何影響癌癥的發病機制仍有待探索。更重要的是，以往關于抗氧化劑攝入量對癌癥患者影響的研究結論還需要進一步證實[25]。目前，關于抗氧化劑補充劑與癌癥之間關系的大型隨機臨床試驗也產生了相互矛盾的結果[26]。比如補充抗氧化劑如維生素E已被證明會促進前列腺癌的發展，這表明抗氧化劑會增加患癌癥的風險[27]。

Trx在癌細胞中調節耐藥性的途徑有很多，并且相互關聯[28]。考慮到腫瘤細胞對藥物的反應是一個環境依賴的過程，受微環境、細胞類型和狀態等多種因素的調控。需要進一步的研究來證實AUR作為新興的TXNRD1拮抗劑與惡性腫瘤化療藥物之間的相互作用機制。

綜上所述，化療藥物引起的細胞內ROS水平升高會損害癌細胞，耐藥細胞中TXNRD1的表達上調緩解了ROS的蓄積壓力并維持了細胞內氧化還原穩態，從而阻斷與細胞凋亡相關的細胞死亡過程，導致藥物耐藥性的產生。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、 受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：章愛斌負責文章整體構思和設計；李大志負責數據分析，撰寫論文；黃俊杰參與撰寫及修改論文；鄭樹森、章愛斌負責指導撰寫文章并最終定稿。