TXNRD1在肝細胞癌中活性氧相關(guān)細胞凋亡導(dǎo)致多藥耐藥性中的作用

李大志， 黃俊杰， 鄭樹森， 章愛斌

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 a.多器官聯(lián)合移植重點實驗室， b.肝膽外科， 杭州 310000

肝細胞癌(HCC)在世界各地有著很高的發(fā)病率和死亡率，特別是在亞洲、非洲和南歐。目前，HCC已經(jīng)成為全球第五大常見癌癥和第三大癌癥死亡原因[1]。在我國，HCC的發(fā)病率和死亡率分別排在第四位和第二位，且HCC患者預(yù)后在臨床上仍不盡如人意[2]。對于那些無法手術(shù)的患者而言，化學(xué)藥物治療的效果常受到藥物耐藥性的限制，特別是多重耐藥性(multi-drug resistance，MDR)[3]。

MDR的發(fā)生和發(fā)展是一個涉及多種因素的極其復(fù)雜的過程。先前研究[4]證實上皮/間質(zhì)轉(zhuǎn)化、ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的表達、DNA損傷修復(fù)和藥物外排蛋白的過度表達都與MDR密切相關(guān)。代謝扭曲和過度復(fù)制引起的過度氧化應(yīng)激是癌細胞的共同特征[5]。目前，代謝重編程也被認為是癌癥的標志。細胞信號通路的異常激活使癌細胞面臨更大的氧化應(yīng)激壓力。隨著細胞活性氧(ROS)蓄積，癌細胞只有增加抗氧化能力，才能對抗ROS誘導(dǎo)的細胞調(diào)亡[6]。硫氧還蛋白(TXN)、硫氧還蛋白還原酶(TXNRD)和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)構(gòu)成細胞內(nèi)硫氧還蛋白系統(tǒng)(Trx)，該系統(tǒng)對還原-氧化 (氧化還原) 穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。TXNRD是一種含硒酶和NADPH依賴性黃素蛋白，可將氧化的TXN還原為其二硫醇形式以維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)[7]。NF-E2相關(guān)因子2 (Nrf2) 是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，通過Nrf2/ARE通路調(diào)節(jié)包括TXNRD1 在內(nèi)的眾多細胞保護基因的表達[8]。有趣的是，在各種實體癌如HCC[9]、結(jié)腸直腸癌[10]、前列腺癌[11]中, Trx常常被激活并且TXNRD1過表達。此外，TXNRD1 可以作為HCC患者的預(yù)后因素[12]。

相關(guān)臨床研究[13]也證實，癌細胞清除ROS的能力是癌癥患者預(yù)后的指標之一。臨床樣本TXNRD1表達的增加與晚期臨床分期和較差的患者存活率呈正相關(guān)。化療藥物通過破壞靶細胞中的氧化還原穩(wěn)態(tài)，進一步導(dǎo)致細胞死亡以達到治療效果?？梢酝茰yTXNRD1表達高的病例更有可能對化療藥物產(chǎn)生抗藥性。TXNRD1抑制劑——金諾芬(AUR)，由于其眾所周知的安全毒性特征，該化合物被批準用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。目前，AUR對于其他疾病(包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病)的潛在治療價值也在探索中[14]。

本研究擬通過siRNA敲低或AUR藥物抑制TXNRD1的活性，探究TXNRD1在藥物耐藥性中發(fā)揮的作用，并通過N-乙酰半胱氨酸(NAC)進行ROS耗竭來探索ROS介導(dǎo)耐藥性的可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系和轉(zhuǎn)染 人HCC細胞系BEL/FU和親本細胞系BEL-7402購買于KeyGen Biotech Co., Ltd.(中國南京)。 BEL/FU細胞和BEL-7402細胞在含有10% FBS(BI, 以色列)的 RPMI-1640(BI，以色列)培養(yǎng)基中于5% CO2和37 ℃下培養(yǎng)。在具有50%細胞密度的 6孔板中進行轉(zhuǎn)染。Lipofectamine 3000試劑(Thermo Scientific，美國)和Opti-MEM根據(jù)制造商的說明使用siRNA轉(zhuǎn)染細胞。TXNRD1si-1上游引物：GCAAGACUCUGAAAUUUTT； TXNRD1si-1下游引物：AUAAUUUCGAGAGUCUUGCTT； TXNRD1si-2上游引物：GGA AGAACAUGGCAUCAAGUUTT； TXNRD1si-2下游引物：AACUUGAUGCCAUGUUCUUCCTT。然后，收集細胞用于基因表達測定。

1.2 集落形成試驗 通過在6孔板中接種BEL/FU細胞進行集落形成試驗。用5-氟尿嘧啶(5-Fu)、多柔比星(DOX)和AUR處理48 h后，將細胞在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d。然后，將菌落用結(jié)晶紫染色進行計數(shù)。

1.3 藥物細胞毒性和細胞增殖試驗 化療藥物的細胞毒性由CCK-8法測定，計算藥物半抑制濃度(IC50值)，觀察藥物的細胞毒性。為了評估細胞增殖，將BEL/FU細胞(2×103個/孔)置于96孔板中，并在0、24、48、72和96 h通過CCK-8試劑(DOJINDO Laboratories，日本)檢測，操作依據(jù)試劑的操作說明。

1.4 蛋白質(zhì)印跡 RIPA緩沖液(Thermo Scientific，美國)和BCA 蛋白質(zhì)檢測試劑盒(Thermo Scientific，美國)用于檢測蛋白質(zhì)濃度。將30 μg蛋白質(zhì)加載到4%～20% SDS-PAGE(Life Technology，USA)上進行分離，然后轉(zhuǎn)移到0.2 μm PVDF膜(Millipore，USA)上， 5%脫脂牛奶封閉2 h后，將膜與適當(dāng)?shù)囊豢?(1∶1000) 在4 °C下孵育過夜。隨后，將條帶洗滌并與相應(yīng)的HRP偶聯(lián)二抗 (1∶5000) 一起孵育。通過 EZ-ECL(Biological Industries, 以色列) 檢測蛋白質(zhì)表達。使用Image Lab軟件分析條帶密度以量化蛋白質(zhì)量。

1.5 ROS檢測 收獲細胞并用PBS洗滌。然后，將細胞重新懸浮在PBS中，并與2 μL CellROX Green Reagent(Thermo Scientific，美國)共孵育30 min。通過流式細胞術(shù)測量細胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果以熒光強度表示。

1.6 RNA分離和實時定量PCR(RT-PCR) 使用TRIzol試劑(Invitrogen)從細胞系中提取總RNA。 PrimeScript RT-PCR試劑盒(TaKaRa Biotechnology，中國)用于逆轉(zhuǎn)錄。 SYBR Green PCR 試劑(TaKaRa)用于使用Bio-Rad PCR儀器(CA，美國)進行RT-PCR。所用引物見表1。

表1 引物序列

1.7 異種腫瘤移植模型測定 為了探究TXNRD1在體內(nèi)耐藥機制中發(fā)揮的作用，從杭州子源實驗動物科技有限公司購買了4周大的免疫缺陷裸鼠[許可證：SCXK(浙)2019-0004]構(gòu)建了異種腫瘤移植模型。將5×106個BEL/FU細胞皮下接種到每只小鼠的右脅腹中。 接種3 d后，小鼠接受藥物治療。腫瘤體積的計算公式為：體積=(長×寬×寬)/2。當(dāng)腫瘤體積大于2000 mm3或者達到觀察終點時，處死小鼠。

1.8 倫理學(xué)審查 研究中的所有動物實驗程序均獲得浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會的批準，批號：(2020)實動快審第(7-1)號。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TXNRD1在HCC組織和多重耐藥細胞系BEL/FU中的表達情況 通過癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)集分析證實 TXNRD1在癌組織中高表達，與正常肝組織相比，HCC組織中TXNRD1的mRNA水平顯著上調(diào)(P<0.001)(圖1a)。病理分級Ⅲ、Ⅳ級患者的TXNRD1表達水平高于病理分級Ⅰ、Ⅱ級的患者(P=0.006)(圖1b)。與正常細胞系LO2相比，HCC細胞系的TXNRD1在mRNA水平均明顯上調(diào)(P值均<0.01)(圖1c)，蛋白表達水平與mRNA表達趨勢一致(P值均<0.05)(圖 1e)。BEL/FU細胞系和BEL-7402細胞系中5-Fu和DOX的IC50值具有明顯差異(P值均<0.001)(圖1f、g)。BEL/FU細胞中的TXNRD1較親本BEL-7402細胞在mRNA水平上調(diào)(P=0.004)(圖1d)，蛋白表達水平與mRNA表達趨勢一致(P<0.05)(圖1h)。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，BEL/FU細胞系中的Nrf2水平較親本BEL-7402細胞系在胞質(zhì)蛋白中無明顯差異(P=0.693)，而胞核蛋白中水平較高(P<0.05)(圖1i)。

2.2 TXNRD1抑制使BEL/FU細胞對5-Fu和DOX敏感 為了探究TXRND1的功能，利用 siRNA沉默TXNRD1在BEL/FU細胞中的表達。在設(shè)計的siRNA中，TXNRD1-1 (si-1#) 和TXNRD1-2 (si-2#) 在抑制TXNRD1表達方面最有效，且可特異性敲低TXNRD1的mRNA水平(P值均<0.001)，而不影響TXNRD2和TXNRD3的mRNA水平(P值均>0.05)(圖2a)。對不同細胞系中TXNRD1蛋白的表達進行檢測，結(jié)果也證實了si-1#和si-2#明顯抑制了TXNRD1蛋白的表達(P值均<0.05)(圖2b)。si-1#和si-2#細胞在5-Fu (1000 μmol/mL)和DOX(5 μmol/mL)干預(yù)下，細胞活力顯著低于si-Ctrl(P值均<0.05)(圖2c、d)。在5-Fu (1000 μmol/mL)和DOX(5 μmol/mL)的處理下，si-1#和si-2#細胞克隆形成均較si-Ctrl明顯減少(DOX：P值均<0.001；5-Fu：P值分別為0.043、0.015)(圖2e)。

注：a，正常肝組織和HCC組織中TXNRD1的mRNA水平(TCGA數(shù)據(jù)集)； b，不同病理分級患者的TXNRD1表達水平；c，正常肝細胞LO2和HCC細胞中TXNRD1的mRNA水平；d，BEL/FU和BEL-7402細胞系中TXNRD1的mRNA水平；e，HCC細胞系和LO2中TXNRD1的蛋白質(zhì)水平；f、g，BEL/FU和BEL-7402細胞系中5-Fu、DOX的IC50值；h，BEL/FU和BEL-7402細胞系中TXNRD 1的蛋白水平；i，BEL/FU和BEL-7402細胞系中的Nrf2表達水平。CP，細胞質(zhì)蛋白，NP,核蛋白。

2.3 siRNA敲低TXNRD1通過破壞細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)重塑藥物敏感性 ROS抑制劑NAC是常用的ROS清除劑。經(jīng)體外流式細胞術(shù)檢測，si-1#和si-2#細胞的ROS水平較si-Ctrl明顯升高(P值均<0.001)，經(jīng)過NAC (0.5 mmol/L)處理24 h后，細胞的ROS水平均有所下降(P值均<0.001)(圖3a)。當(dāng)BEL/FU細胞中的TXNRD1被si-1#和si-2#敲低時，經(jīng)5-Fu(1000 μmol/mL)作用24 h后，細胞凋亡比例明顯增加(P值均<0.001)；同期進行NAC(0.5 mmol/L)干預(yù)，可以降低BEL/FU細胞凋亡比例(P值均<0.001)(圖3b)。經(jīng)DOX (5 μmol/mL)作用24 h后，細胞凋亡比例明顯增加(P值均<0.001)；同期進行NAC(0.5 mmol/L)干預(yù)，可以降低BEL/FU細胞凋亡比例(P值均<0.001)(圖3c)。蛋白免疫印跡結(jié)果證實，si-Ctrl細胞內(nèi)Caspase-3、Survivin蛋白的表達水平及Bcl-2 /Bax比率均較BEL/7402細胞、si-1#和si-2#細胞升高(P值均<0.05)(圖4)。

注：a，BEL/FU細胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#中TXNRD1、TXNRD2、TXNRD3的mRNA水平；b，BEL/FU細胞系未處理組、si-Ctrl、si-1#、si-2#中TXNRD1的蛋白質(zhì)水平；c、d，BEL/FU細胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#應(yīng)用DOX、5-Fu藥物后的OD450 nm吸光度曲線；e，BEL/FU細胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#應(yīng)用DOX、5-Fu藥物后的細胞克隆集落形成。

注：a，BEL/FU細胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#、si-1#+NAC、si-2#+NAC細胞內(nèi)ROS含量； b，BEL/FU細胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#應(yīng)用5-Fu或5-Fu聯(lián)合NAC后細胞凋亡比例；c，BEL/FU細胞系si-Ctrl、si-1#、si-2#應(yīng)用DOX或DOX聯(lián)合NAC后細胞凋亡比例。

圖4 BEL/7402和BEL/FU細胞系中細胞凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)表達

2.4 AUR是BEL/FU細胞的有效藥物增敏劑 AUR對TXNRD1具有抑制作用。BEL/FU細胞和BEL-7402細胞對AUR的藥物敏感性(IC50值)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.153)(圖5a)。經(jīng)AUR (0.3 μmol/L) 處理后BEL/FU細胞系中5-Fu與DOX的IC50值明顯下降(P值均<0.01)(圖5b、c)。BEL/FU細胞在AUR(0.3 μmol/L)與5-Fu(1000 μmol/mL)不同分組處理條件下細胞活力變化如圖所示(圖5d)。在AUR(0.3 μmol/L)聯(lián)合DOX(5 μmol/mL)處理組細胞克隆形成較DMSO、DOX(5 μmol/ml)組明顯減少(P值均<0.001)(圖5e)；在AUR(0.3 μmol/L)聯(lián)合5-Fu(1000 μmol/mL)處理組細胞克隆形成較DMSO、5-Fu組(1000 μmol/mL)明顯減少(P值均<0.001)(圖5f)。相同濃度下BEL /FU細胞經(jīng)AUR聯(lián)合5-Fu處理后細胞凋亡比例較5-Fu處理組明顯升高(P<0.001)，AUR聯(lián)合DOX較DOX處理組也明顯升高(P<0.001)(圖6、7)。

注：a，BEL/7402、BEL/FU細胞系對藥物AUR的IC50； b，BEL/FU細胞系在應(yīng)用AUR前后對5-Fu的IC50；c，BEL/FU細胞系在應(yīng)用AUR前后對DOX的IC50；d，BEL/FU細胞系在應(yīng)用DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu藥物后的OD450 nm吸光度曲線；e，BEL/FU細胞系在應(yīng)用DMSO、DMSO+DOX、DMSO+AUR、AUR+DOX藥物后的細胞克隆集落形成；f，BEL/FU細胞系在應(yīng)用DMSO、DMSO+5-Fu、DMSO+AUR、AUR+5-Fu藥物后的細胞克隆集落形成。

圖7 不同分組BEL/FU細胞的調(diào)亡比例比較

2.5 AUR可有效改善BEL/FU細胞體內(nèi)5-Fu耐藥性 通過將BEL/FU細胞接種在免疫缺陷小鼠的皮下，構(gòu)建異種移植模型，對AUR的體內(nèi)治療效果進行評估。用DMSO、AUR(6 mg·kg-1·d-1，皮下注射)、5-Fu(25 mg·kg-1·d-1，皮下注射)或藥物聯(lián)合處理對接種BEL/FU細胞的異種移植物小鼠進行分組并進行處理觀察9 d。不同分組在觀察終點的腫瘤大小如圖8a所示，不同分組的腫瘤生長曲線如圖8b所示。觀察終點時，AUR處理組與DMAO處理組相比，腫瘤治療無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.063)，AUR聯(lián)合5-Fu組較單一5-Fu處理組抑制腫瘤生長的能力明顯提升(P<0.001)(圖8c)。觀察終點時，AUR聯(lián)合5-Fu組較單一5-Fu處理組腫瘤質(zhì)量明顯縮小(P<0.001)(圖8d)。觀察期間各組小鼠體質(zhì)量變化曲線如圖8e所示。

3 討論

感染、紫外線、煙草、酒精等外界因素的干擾會導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS水平升高，而這些因素亦是導(dǎo)致癌癥的因素。以往的研究[15]表明，癌癥的發(fā)生、進展、血管生成和轉(zhuǎn)移與ROS密切相關(guān)。由于癌細胞的代謝活性增強和信號通路的異常激活，使它們具有比正常細胞更高的基礎(chǔ)ROS水平[16]。因此，癌細胞需要更完善和可靠的ROS消耗途徑來應(yīng)對由細胞內(nèi)較高ROS水平引起的氧化應(yīng)激，以避免細胞凋亡[17]。更重要的是，傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物和放療作為經(jīng)典的抗腫瘤方法會增加癌細胞中的ROS水平。這些干預(yù)措施會導(dǎo)致DNA損傷、細胞周期停滯甚至細胞凋亡，但癌細胞強大的抗氧化系統(tǒng)可以保持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，因此這些治療措施難以達到理想的效果。

5-Fu與DOX作為臨床化療藥物的常見選擇，耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)往往使化療不能取得理想的治療效果。筆者先前的研究[18-19]也證實，源自BEL-7402細胞系的BEL/FU細胞對5-Fu和DOX具有穩(wěn)定的耐藥性，為了研究耐藥相關(guān)的分子機制，筆者選取了實驗室保存的肝癌細胞BEL-7402的5-Fu與DOX多重耐藥株BEL/FU細胞，并發(fā)現(xiàn)TXNRD1在BEL/FU細胞中表達升高；通過siRNA下調(diào)TXNRD1蛋白的表達水平后，BEL/FU細胞對藥物5-Fu與DOX的敏感性明顯增加。結(jié)合先前研究結(jié)果，筆者認為在肝癌細胞中TXNRD1表達上調(diào)可能通過增強DNA的損傷修復(fù)能力從而增加了細胞對藥物5-Fu與DOX的耐受性；而TXNRD1的抑制則干擾了dNTPs庫，從而干預(yù)了DNA的損傷修復(fù)，或者通過 Bcl-2/Caspase信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡，從而增強了細胞對藥物的敏感性。

注：a，經(jīng)DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu處理后，BEL/FU成瘤大體圖片； b，經(jīng)DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu處理后，BEL/FU腫瘤體積變化曲線；c，經(jīng)5-Fu、AUR+5-Fu處理后，BEL/FU腫瘤觀察終點時體積； d，經(jīng)DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu處理后，BEL/FU腫瘤觀察終點時質(zhì)量；e，經(jīng)DMSO、AUR、5-Fu、AUR+5-Fu處理后，裸鼠體質(zhì)量變化曲線。

AUR是一種臨床上用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物，能夠有效抑制TXNRD1的活性。許多研究表明AUR在癌癥治療中具有良好的耐受性和安全性。單獨干預(yù)TXNRD1和/或與傳統(tǒng)的抗腫瘤方法(藥物治療、放療等)結(jié)合來干擾癌細胞中氧化還原穩(wěn)態(tài)是一個可行的策略。這一發(fā)現(xiàn)不僅見于實體瘤，如乳腺癌[20]、肝癌[21]，也見于血液系統(tǒng)腫瘤[22]。本研究結(jié)果證實TXNRD1是干預(yù)耐藥癌細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的合適靶點，這為對化療藥物耐藥的患者提供了一個新的選擇。TXNRD1表達水平與HCC預(yù)后之間的密切關(guān)系表明它可作為治療靶點[23]。此外，癌細胞的基礎(chǔ) ROS水平高于正常細胞，使它們更容易受到這種干預(yù)。此外，TXNRD1的肝細胞特異性敲除不影響肝臟生長和再生率[24]，即AUR作為 TXNRD1抑制劑不影響肝臟正常功能，而是選擇性靶向癌細胞。

抗氧化劑廣泛存在于食用的各種飲食原材料中。但每天攝入的抗氧化劑如何影響癌癥的發(fā)病機制仍有待探索。更重要的是，以往關(guān)于抗氧化劑攝入量對癌癥患者影響的研究結(jié)論還需要進一步證實[25]。目前，關(guān)于抗氧化劑補充劑與癌癥之間關(guān)系的大型隨機臨床試驗也產(chǎn)生了相互矛盾的結(jié)果[26]。比如補充抗氧化劑如維生素E已被證明會促進前列腺癌的發(fā)展，這表明抗氧化劑會增加患癌癥的風(fēng)險[27]。

Trx在癌細胞中調(diào)節(jié)耐藥性的途徑有很多，并且相互關(guān)聯(lián)[28]?？紤]到腫瘤細胞對藥物的反應(yīng)是一個環(huán)境依賴的過程，受微環(huán)境、細胞類型和狀態(tài)等多種因素的調(diào)控。需要進一步的研究來證實AUR作為新興的TXNRD1拮抗劑與惡性腫瘤化療藥物之間的相互作用機制。

綜上所述，化療藥物引起的細胞內(nèi)ROS水平升高會損害癌細胞，耐藥細胞中TXNRD1的表達上調(diào)緩解了ROS的蓄積壓力并維持了細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而阻斷與細胞凋亡相關(guān)的細胞死亡過程，導(dǎo)致藥物耐藥性的產(chǎn)生。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、 受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：章愛斌負責(zé)文章整體構(gòu)思和設(shè)計；李大志負責(zé)數(shù)據(jù)分析，撰寫論文；黃俊杰參與撰寫及修改論文；鄭樹森、章愛斌負責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最終定稿。