線粒體靶向抗氧化劑SS-31對膿毒癥小鼠模型急性肝損傷的影響

滿明銀， 李娜娜， 卜 月，于凱江

哈爾濱醫科大學附屬第一醫院 重癥醫學科， 哈爾濱 150000

膿毒癥是嚴重感染引起的宿主反應失調導致的致命性器官功能障礙[1]。2016年的一項薈萃分析[2]顯示，每年可能有530萬人因膿毒癥而死亡。導致膿毒癥患者死亡的主要原因是多器官衰竭。肝臟具有解毒、代謝、合成、分泌等重要功能，對于維持人體生理穩態具有重要作用[3]。肝臟也是人體重要的免疫器官[4]，是膿毒癥最易損傷的器官之一[5]。研究[6]表明，膿毒癥相關肝損傷發病率為34.7%。相關研究[7]認為，肝臟的損傷常發生在膿毒癥早期。膿毒癥相關肝損傷按照發病機制可分為原發性和繼發性，繼發性肝損傷為促炎因子及活性氧自由基(ROS)等所致損傷[8]。

SS-31(在文獻中也被稱為Elamipretide, MTP-131, BendaviaTM)是一種水溶性、芳香陽離子線粒體靶向四肽。近年來在不同病因引起的線粒體功能障礙的相關研究[9-12]中，SS-31被證明可在包括腎臟、腦、心臟和骨骼肌在內的多個器官中改善線粒體功能，抑制線粒體ROS 的產生、降低促炎介質水平。但目前尚未有SS-31在膿毒癥相關急性肝損傷中的研究，尚不清楚其能否減輕膿毒癥相關肝損傷。

本實驗通過觀察SS-31能否減少膿毒癥小鼠氧自由基的釋放及促炎因子的產生，從而對膿毒癥相關急性肝損傷起到抗炎、抗氧化的保護作用，進而為膿毒癥肝損傷的防治提供新的治療靶點及靶向治療藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用6～8周齡SPF級C57BL/6J 雄性小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，體質量19～23 g。實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0011；實驗動物使用許可證號：SYXK(黑)2021-004。

1.1.2 主要儀器和試劑 微量冷凍離心機(美國Thermo公司)，高速冷凍離心機(美國Thermo公司)，-80 ℃冰箱(美國Thermo公司)，實驗室純水凈化器(美國Thermo公司)，精密電子天平(瑞士Mettler Devices公司)，多功能酶標儀(美國MD SpectraMax M5)，小動物麻醉機(美國 Surgivet 公司)；ELISA試劑盒(江蘇酶免實業有限公司)，PBS 1×(500 mL)(美國SIGMA公司)，SS-31(杭州專肽生物技術有限公司)。

1.2 模型制備

1.2.1 實驗動物分組 24只實驗小鼠隨機分為對照組(control組) 、治療藥物組(control+SS-31組)、膿毒癥肝損傷組(LPS組) 、膿毒癥肝損傷 +治療藥物組(LPS+SS-31組) ，每組均為 6 只。

1.2.2 模型建立 實驗小鼠在實驗前12 h 開始禁食，實驗前4 h 禁水。造模前各小鼠稱重，control組、control+SS-31組小鼠按體質量給予10 mL/kg的PBS液腹腔注射，LPS 組、LPS+SS-31組小鼠按體質量給予10 mL/kg 的LPS( PBS液稀釋至1 mg/mL) 腹腔注射。繼之control組、LPS組小鼠按體質量給予生理鹽水10 mL/kg腹腔注射，control+SS-31組、LPS+SS-31組小鼠給予SS-31(生理鹽水溶解至1 mg/mL) 10 mg/kg腹腔注射。注射器為胰島素針 30號5/16(0.3 mm×8 mm)。

1.3 取材

1.3.1 動物麻醉及取材準備 4組小鼠于模型建立12 h后使用小動物麻醉機在小鼠活體狀態下給予異氟烷實行吸入麻醉。麻醉滿意后，固定于仰臥位，于腹正中線行1.5～2.0 cm 的縱行切口，充分暴露胸腹部，取心腔血及肝組織。

1.3.2 血標本采集 充分暴露胸部后，以 1 mL注射器緩慢抽血，收集血液試管為EP管(每管內預先加入10 μL肝素抗凝)，血液收集完畢后混勻，置于冰盒中靜置15 min后，4 ℃條件下離心(4000 r/min) 5 min，取上清液，分裝做好標記，-80 ℃冰箱保存，待行血清肝功能檢測。

1.3.3 組織標本采集 小鼠處死后，打開腹腔，游離并取出肝臟，每只小鼠取出肝臟的左外側葉置入4%多聚甲醛溶液中固定48 h，然后進行石蠟包埋、切片，并行HE染色，觀察病理組織學改變；剩余肝臟組織保存于-80 ℃冰箱。

1.4 檢測方法

1.4.1 小鼠血清指標檢測 取上清液，采用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中ALT、AST的濃度值。依次將5組不同濃度的標準品加入室溫平衡20 min后酶標板中，將解凍后的10 μL待檢樣品和40 μL樣品稀釋液先后加入預先設計的待檢樣品孔中，除空白孔外，每孔加入由過氧化物酶(HRP)標記的抗體 100 μL，用封板膜封住反應孔，37 ℃恒溫箱中孵育 60 min。倒掉上層液體，拍干，用稀釋后的洗滌液反復洗板 5 次，在所有孔中先后加入底物A、B各 50 μL，37 ℃避光孵育15 min。加入終止液 50 μL，通過多功能酶標儀測定 450 nm 處吸光度值，再根據計算公式得出實際樣品濃度。操作嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.4.2 小鼠肝臟病理切片 小鼠肝臟組織浸泡于甲醛溶液中固定48 h后，將肝臟組織進行修型，放置于石蠟包埋盒中經過脫水、透明、浸蠟等過程，進行包埋。包埋后進行組織切片，厚度為 4 μm，將載有石蠟切片的載玻片置于60 ℃烤箱中烘烤2 h，置于室溫過夜。石蠟切片經脫蠟、組織軟化、蘇木精染色、鹽酸乙醇分化、伊紅染色、脫水、透明后封片。HE染色后切片于顯微鏡下觀察其病理變化。

1.4.3 ELISA 法測定小鼠肝組織ROS、超氧化物歧化酶(SOD)、IL-1β、IL-6、TNFα 水平 取0.1 g 肝組織，置于冰上剪碎后置于EP管中，加入 PBS 液900 μL，充分研磨至組織勻漿，4 ℃條件下離心(3000 r/min)20 min，取上清液并做好標記，并使用ELISA試劑盒進行檢測。檢測過程嚴格按照ELISA試劑盒檢測方法及說明書進行。

1.5 倫理學審查 本研究方案經由哈爾濱醫科大學實驗動物倫理委員會審批，批號：2021037，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結果

2.1 各組小鼠表現 各組小鼠模型制備完成后12 h觀察各組小鼠狀態。4組小鼠均無死亡，control組及control+SS-31組小鼠較造模前未見明顯異常表現；LPS組及LPS+SS-31組小鼠出現不同程度的精神萎靡、少動、蜷縮、毛發豎起、大便不成形等情況，其中LPS+SS-31組小鼠上述異常表現程度較LPS組輕。各組間小鼠體質量比較，差異無統計學意義(表1)。

2.2 各組小鼠血清指標比較 為檢測SS-31能否減輕膿毒癥肝損傷，比較4組小鼠血清中 ALT、AST水平。與control組比較，LPS組小鼠血清中 ALT、AST水平均顯著升高(P值均<0.05);與LPS組小鼠比較，LPS+SS-31組小鼠血清中 ALT、AST水平均顯著降低(P值均<0.05)(表1)。

2.3 各組小鼠氧化應激指標比較 為檢測SS-31能否減輕膿毒癥小鼠氧化應激，比較4組小鼠肝組織勻漿上清液中ROS、SOD水平。與control組比較，LPS組小鼠中ROS、SOD水平顯著改變(P值均<0.05);與LPS組小鼠比較，LPS+SS-31組小鼠中ROS水平顯著降低(P<0.05)(表1)。

2.4 各組小鼠炎性指標水平比較 為檢測SS-31能否改變膿毒癥小鼠肝組織中炎癥介質水平，比較4組小鼠肝組織勻漿上清液中TNFα、IL-1β、IL-6水平。與control組比較，LPS組小鼠中TNFα、IL-1β、IL-6水平均顯著升高(P值均<0.05);與LPS組小鼠比較，LPS+SS-31組小鼠中TNFα、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P值均<0.05)(表1)。

表1 4組小鼠各指標比較

2.5 各組小鼠肝組織病理切片比較 與 control組比較，LPS 組小鼠肝組織切片HE染色顯示出肝小葉結構破壞、炎性細胞浸潤、細胞間隙模糊、肝細胞腫脹; LPS+SS-31組炎性細胞浸潤減少，肝細胞腫脹減輕(圖1)。

注：a， control組；b，control+SS-31組；c，LPS組；d，LPS+SS-31組。圖1 肝組織病理切片(HE染色，×400)

3 討論

本實驗采用小鼠動物模型，通過監測ALT、AST來反映不同組別膿毒癥小鼠的肝損傷情況，并分別從氧化應激、炎癥反應、組織病理等多個角度進行分析，探討線粒體靶向肽SS-31對小鼠膿毒癥肝損傷的作用。

膿毒癥時易引起包括肝臟在內的多器官損傷，進一步導致器官功能障礙甚至衰竭，在微觀上線粒體是膿毒癥時易受損傷和出現功能障礙的細胞器，膿毒癥所引起的線粒體功能障礙在影響機體ATP能量產生和供應的同時，也引起了大量氧自由基的釋放，進一步加重了機體損傷，促進了膿毒癥器官損傷的發展。而肝臟作為人體內最大的解毒和免疫器官，當肝細胞受到嚴重損傷時，其合成、代謝、解毒、分泌與免疫功能發生嚴重障礙，其對內毒素的清除上發生障礙，反過來加劇了機體的損傷。既往相關研究[9,13-15]表明，SS-31可通過改善線粒體氧化呼吸鏈中復合物活性、穩定心磷脂改善膜的生物物理性能、減輕線粒體質子泄漏、減少ROS產生等途徑改善線粒體功能，減少ROS釋放。

本實驗研究結果顯示，與control組相比，小鼠腹腔注射LPS后12 h，血清中ALT、AST水平均顯著升高，表明 LPS 誘發小鼠產生了膿毒癥，發生了肝損傷，這與既往研究[16]結果一致。本實驗結果表明,使用線粒體靶向肽SS-31后可以減輕膿毒癥小鼠的急性肝損傷，且與LPS組相比發現腹腔注射SS-31后降低了膿毒癥小鼠模型中的ROS含量，這可能是通過SS-31改善了膿毒癥小鼠體內的線粒體功能實現的。ROS可作用于核因子(NF) -κB、活化蛋白-1等氧化還原敏感性轉錄因子，從而調節促炎基因的轉錄，增加炎癥介質釋放，加重炎癥反應。本實驗結果表明，SS-31可減少小鼠高表達的TNFα、IL-1β、IL-6等炎性因子，這與既往研究[17-18]一致。既往大量研究[19]證實，NF-κB是膿毒癥炎癥反應的重要通路，SS-31可下調年齡相關的NF-κB的激活，SS-31通過改善線粒體功能，減少ROS的釋放，進而減少NF-κB通路的激活及炎癥介質釋放可能是SS-31減輕炎癥反應的重要機制之一。氧化應激產生的大量ROS可導致體內SOD消耗，使SOD濃度降低，但本實驗使用SS-31未能逆轉SOD的降低，這可能與SS-31使用后仍超過某一“閾值”導致SOD被消耗有關。既往相關研究[20-21]證明了SS-31應用的安全性與耐受性良好，在本實驗中，與對照組相比，未發現注射SS-31藥物后小鼠產生不良反應，為SS-31應用的安全性提供了支持。

綜上所述，本實驗結果表明在膿毒癥小鼠腹腔注射SS-31治療后，可減少體內ROS的產生，下調膿毒癥時高表達的炎性因子，從而減輕小鼠膿毒癥肝損傷。通過對線粒體功能開展多方面機制研究，線粒體靶向藥物有望為膿毒癥的治療提供新的靶點。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：滿明銀負責課題設計，資料分析，撰寫論文；李娜娜參與收集數據，修改論文；卜月負責實驗及修改論文；于凱江負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。