TFRs占Tregs的比例與HIV感染疾病進展的相關性分析

鄧明惠，侯 軒，王 輝，段發強

艾滋病是由HIV感染導致的重大傳染性疾病。自1981年發現HIV以來，經過40年的研究，人們對艾滋病的了解越來越深入。研究發現HIV感染過程中會導致機體過度免疫活化，機體免疫活化水平與疾病的進展密切相關[1]，與HIV RNA呈正相關，與CD4+T細胞計數呈負相關[2]。在HIV感染過程中，與典型進展人群相比，長期不進展人群（HIV感染10年以上，未經過抗病毒治療，CD4+T細胞計數保持500個/μl以上，HIV RNA處于低水平）的免疫活化水平明顯較低[3]。

調節性T細胞（regulatory T cells, Tregs）是CD4+T細胞的一個亞群，具有抑制免疫活化及免疫反應的作用[4]。在一般非艾滋感染性疾病及腫瘤中，Tregs通過抑制免疫活化與免疫反應對機體發揮不利的作用。但在HIV感染中，Tregs對機體發揮雙重作用，是一把“雙刃劍”：一方面通過抑制免疫活化對機體發揮有利的作用；另一方面通過抑制免疫反應對機體發揮不利的作用[5]。Tregs與HIV感染疾病進展的關系表明，Tregs計數與疾病進展呈負相關，即與HIV RNA呈負相關，與CD4+T細胞計數呈正相關[4-5]。而Tregs占CD4+T細胞的比例與HIV感染疾病的進展呈正相關，即Tregs占CD4+T細胞的比例越高，患者的病毒載量越高，CD4+T細胞水平越低[6]。但在極晚期患者中，Tregs細胞的比例高，與患者的生存能力及療效呈正相關，即Tregs對于極晚期患者機體發揮有利的作用[6]。

濾泡調節性T細胞（follicular regulatory T cells, TFRs）是近年發現的表達CCR5的一個Tregs亞群，主要存在淋巴結生發中心[7]。生發中心是HIV感染的重要場所，TFRs也是HIV感染的靶標，由于TFRs具有Tregs細胞的特征，具有抑制免疫活化及免疫反應的作用，淋巴結生發中心也是免疫調節的重要場所，因此，TFRs與HIV感染疾病進展的關系非常復雜。有研究認為TFRs與HIV感染疾病進展呈負相關，即與CD4+T細胞計數呈正相關，與HIV RNA呈負相關[8]。了解TFRs占Tregs的比例與HIV感染疾病進展的關系，可以進一步了解Tregs亞群分布與HIV感染疾病進展的關系，為該疾病的治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 對象 將2016—2020年于漢中三二〇一醫院就診和隨訪的HIV感染者納入研究，共94例。其中未治療HIV感染者54例，抗HIV治療后免疫重建成功者23例，抗HIV治療后免疫重建失敗者17例。同時納入性別（由于目前HIV感染者主要以男性為主，此次納入的均為男性人群）和年齡相匹配的在漢中三二〇一醫院健康體檢者32例作為健康對照。入組HIV感染者的一般特征見表1。本研究獲得醫院倫理委員會批準。

表1 HIV感染者的一般特征Table 1 General characteristics of HIV infected patients

1.2 診斷標準與定義 HIV感染者的診斷標準參照《中國艾滋病診療指南（2018版）》[8]。免疫重建成功及免疫重建失敗者的入排標準參考姜太一等[9]發表的文獻：在抗病毒治療的2年以上HIV感染者中，有一部分在病毒控制的同時，CD4+T細胞計數恢復到350 個/μl以上的HIV感染者稱之為免疫重建成功者；另外一部分患者，雖然病毒控制的很好，但CD4+T細胞計數不能夠很好的恢復，持續在250 個/μl 以下，并排除合并HBV、HCV及結核感染者，稱之為免疫重建失敗者。

1.3 HIV RNA及CD4+T細胞計數檢測 利用羅氏cobas TaqMan HIV RNA檢測系統進行HIV RNA水平的檢測，應用BD公司的CD3+、CD4+及CD8+T細胞計數檢測試劑盒進行CD4+T細胞計數的檢測。

1.4 Tregs及TFRS檢測 利用流式技術對外周血中的Tregs及TFRs進行檢測。抽取外周抗凝血10 ml，首先用密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞，Tregs及TFRs的染色方案見參考文獻[9]。

1.5 統計學處理 使用SPSS 24.0軟件對數據進行統計學分析，采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行繪圖。一般資料采用描述性分析，計量資料采用中位數（最小值，最大值）表示。組間比較采用Mann–Whitney U 檢驗。相關性分析采用Spearman相關分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TFRs/Tregs比值與疾病進展的相關性分析 在HIV感染過程中，HIV RNA水平及CD4+T細胞計數是反應疾病進展的2個重要指標。本研究首先分析了未治療HIV感染者TFRs/Tregs比值與HIV RNA及CD4+T細胞計數之間的關系，發現TFRs/Tregs比值與HIV RNA呈負相關（r=-0.276，P=0.044）（圖1 A），與CD4+T細胞計數呈正相關（r=0.579，P=0.001）（圖1 B）。

圖1 未治療HIV感染者TFRs/Tregs比值與HIV RNA及CD4+ T細胞計數之間的相關性分析Figure 1 Correlation analysis between TFRs/Tregs ratio, HIV RNA and CD4+ T cell count in untreated HIV infected patients

2.2 不同CD4+T細胞水平未治療HIV感染者TFRs/Tregs比值的比較 一般CD4+T細胞計數＜200個/μl，HIV感染者進入疾病的晚期，即艾滋病期。CD4+T細胞計數在200～350個/μl之間，疾病進入進展期。CD4+T細胞計數＞350個/μl，機體能保持較好的免疫水平。我們根據CD4+T細胞水平的不同，將納入的HIV未治療者分為3組（CD4+T細胞計數≤200個/μl組、200個 /μl＜CD4+T 細胞≤ 350個 /μl組、CD4+T細胞計數＞350個/μl組），并對比分析各組之間TFRs/Tregs比值的差異，發現CD4+T細胞計數＜200個/μl的HIV感染者，其TFRs/Tregs比值明顯低于健康對照組及其他2組（圖2）。

圖2 不同CD4+ T細胞水平未治療HIV感染者與健康對照組，TFRs/Tregs比值的比較Figure 2 Comparison of TFRs/Tregs ratio between untreated HIV infected patients with different CD4+ T cell levels and health controls

2.3 免疫重建成功和免疫重建失敗者TFRs/Tregs比值的比較 研究發現免疫重建失敗組的TFRs/Tregs比值明顯低于免疫重建成功組及健康對照組（P均＜0.05）（圖3）。

圖3 TFRs/Tregs比值在免疫重建成功和免疫重建失敗者中的比較Figure 3 Comparison of TFRs/Tregs ratio in patients with successful and failed immune reconstitution

3 討 論

TFRs是近年發現的一群新的細胞亞群，主要存在于淋巴結[7]，部分存在于外周血。TFRs一方面具有Tregs的特征，具有抑制免疫活化及免疫反應的作用，另一方面也具有濾泡輔助性T細胞的特征，具有輔助B細胞發育及輔助免疫反應的作用。在HIV感染過程中Tregs與疾病進展的關系報道較多，對于TFRs與HIV疾病進展的關系，有研究認為與Tregs是一致的[9]。由于TFRs主要存在于淋巴結，淋巴結生發中心也是CD4+T細胞的富集地，并且相對于外周血，淋巴結的結構致密。因此HIV在淋巴結中的感染率及復制水平遠高于外周血[10]。此外，淋巴結中免疫反應的復雜程度遠高于外周血。外周血中的TFRs的變化與淋巴結中的一致[7]。因此，充分了解TFRs占Tregs的比例與HIV感染疾病進展的關系可進一步了解Tregs及其亞群與HIV感染疾病進展之間的關系。

在本研究中，我們發現TFRs占Tregs的比例與HIV感染疾病進展呈負相關，也就是TFRs占Tregs的比例越高，對機體越有利；也說明CD4+T細胞越低，雖然Tregs和TFRs都受損，但TFRs受損更嚴重。這可能與TFRs除了具有抑制作用外，還有輔助免疫反應的作用有關。研究表明，TFRs主要存在的淋巴結生發中心也是B細胞發育的重要場所，B細胞發育也需要TFRs的輔助作用[11]，TFRs的損傷是否導致其輔助B細胞的作用減弱，從而B細胞抗病毒作用減弱加速了疾病進展，值得進一步研究。

此外，我們還發現免疫重建成功者中TFRs/Tregs的比例遠高于免疫重建失敗者。有研究表明，與免疫重建成功者相比，免疫重建失敗者之所以長期抗病毒不能恢復期免疫水平，可能與病毒嚴重破壞了胸腺及淋巴結結構有關。免疫重建失敗者TFRs/Tregs比例較低，可能與TFRs主要存在于淋巴結，淋巴結結構破壞嚴重，TFRs很難恢復有關[12]。

總之，TFRs是近年發現的Tregs的一個亞群，本研究對TFRs/Tregs比值與HIV疾病進展的關系進行了研究，結果顯示與HIV RNA呈負相關，與CD4+T細胞計數呈正相關，比例越高，機體的免疫狀態有可能越好。但因TFRs主要存在于淋巴結，本研究沒有對淋巴結中的TFRs進行研究是本研究的不足之處。