轉sm-Ngt1 基因水稻遺傳穩定性分析

夏 棟，盧 衛，張 俊，譚艷平，劉學群，王春臺

（中南民族大學生命科學學院/生物技術國家民委重點實驗室/武陵山區特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室，武漢 430074）

糖基轉移酶通過對細胞中不同化合物的糖基化，參與植物各種代謝及代謝的調節［1］。糖基轉移酶參與植物細胞壁多糖的合成，從而介導植物形態建成的過程［2］。糖基轉移酶對微生物分泌的毒素的糖基化修飾使其對病原菌產生抗性，同時參與植物對逆境的防御。糖基轉移酶基因Twi1沉默的轉基因番茄表現出Twi1底物的顯著積累和斑點枯萎病毒的易感性增強，進一步研究其機理發現是由于Twi1可調節番茄植物中的類黃酮槲皮苷和山柰酚水平，從而影響植物對病毒的抵抗力［3］。擬南芥中用PstDC3000 感染后，UGT76D1敲除突變體內二羥基苯甲酸（DHBA）糖苷和SA 水平降低，免疫反應延遲，而過表達UGT76D1會導致SA 大量積累，出現類似HR 的病斑表型，證明UGT76D1通過促進DHBA的糖基化，在SA 平衡和植物免疫反應中發揮重要作用［4］。MeSA 作為植物系統獲得抗性的移動信號同樣在植物體內存在糖基化修飾現象。擬南芥中UGT71C3通過對MeSA 葡萄糖化調節MeSA 和SA的平衡，促進對SAR 響應的負調控［5］。

sm-Ngt1基因是從煙草中分離得到1 個受甲基茉莉酸和水楊酸雙重誘導的基因序列，其具有糖基轉移酶的特性［6］。秦漢花等［7］將sm-Ngt1基因在擬南芥中超表達，發現其具有抗菌核病的功能。胡文［8］將sm-Ngt1基因轉入水稻品種粵泰B（YTB）中，獲得了部分可自花授粉結實的轉基因植株，抗性鑒定表明帶有這些轉基因植株獲得了稻瘟病抗性［9］。

外源基因能否在受體植株中穩定遺傳和表達，直接關系到其商品化和實用化價值［10］。外源基因在受體植株中的表達方式十分復雜，其可能受轉入方法、整合方式、甲基化以及環境條件等因素的影響導致沉默或者丟失。本試驗旨在對外源基因sm-Ngt1在轉基因YTB 植株后代中遺傳穩定性進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

15 個轉sm-Ngt1基因水稻株系（編號見表1）以及非轉基因的轉化受體品種水稻粵泰B（YTB），均由中南民族大學武陵山區特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室提供。

表1 轉sm-Ngt1 基因水稻材料編號

DL2000 DNA Marker、10×DNA loading buffer、rTaq、RNase、10×PCR Buffer、dNTP Mix 均購自Takara 公司；無水乙醇、CTAB、Tris-base、EDTA、氯仿、異戊醇等均為分析純級國產試劑。

根據持家基因actin序列設計了引物actin-F/actin-R，sm-Ngt1基因的CDS 序列設計了2 對引物GT-F1/GT-R1 和GT-F2/GT-R2 用于目的基因檢測；根據農業部轉基因標記物鑒定方法設計9 對檢測引物用于轉基因標記物的檢測［11-13］；序列由昆泰銳（武漢）生物技術有限責任公司合成，具體見表2。

表2 引物序列

1.2 實驗儀器

5415D、5417D 冷凍離心機（德國eppendorf）；BioPhotometer DNA 濃度測定儀（德國eppendorf）；Bio-Rad laboratories MJ Research 041BR-26334 電泳儀（美國）；SBD50-1 Heto-Holten 水浴鍋（丹麥）；Universal Hold II 凝膠成像系統（美國）；C1000 touch thermal cycler PCR 儀（美國Bio-Rad）。

1.3 方法

1.3.1 材料種植 將15 個轉sm-Ngt1基因的株系材料連續兩代（T5、T6 代）和品種YTB 種植在課題組實驗室和華中農業大學農業轉基因生物試驗基地水稻種植區，隨機區組設計，設3 次重復，每個小區面積為11 m2（2 m×5.5 m）。所有材料除全生育期不使用任何防稻瘟藥物外，均按常規栽培管理。

1.3.2 農藝性狀比較 對轉sm-Ngt1基因水稻株系與受體品種進行生育期、株高、結實率及千粒重進行考察和統計分析。

1.3.3 CTAB 法提DNA 取材料長約2 cm 葉片于1.5 mL EP 管中，加入液氮迅速研磨至粉末狀。加入65 ℃預熱的1.67% CTAB 溶液650 μL 于EP 管中，65 ℃條件下保溫1 h。室溫冷卻后加650 μL 的氯仿∶異戊醇（24∶1），4 ℃12 000 r/min 離心10 min，吸取上清于新的1.5 mL EP 管中，加入-20 ℃預冷的無水乙 醇800 μL，在-20 ℃條件 下 冷 卻1 h 后，4 ℃12 000 r/min 離心15 min。沉淀中加入800 μL 75%乙醇，4 ℃12 000 r/min 離心1 min。加入1×TE 緩沖液（含RNase）30 μL 室溫溶解DNA 后保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.4 目的基因sm-Ngt1的PCR 檢測 根據目的基因sm-Ngt1編碼區的序列設計引物，對轉sm-Ngt1基因水稻株系及YTB 的基因組DNA 進行actin和sm-Ngt1基因鑒定。PCR 擴增體系為：10×rTaq buffer 1.5 μL、F、R 引 物（10 μmol/L）各0.25 μL、2.5 mmol/L dNTP Mix 1.0 μL、DNA 模板1.5 μL、5 U/μL rTaq 聚合酶0.1 μL、去離子水10.4 μL；PCR 反應程序為：94 ℃預變性3 min、94 ℃30 s-57 ℃30 s-72 ℃1 min，34 個循環、72 ℃延伸5 min。

1.3.5 轉基因標記物的分子檢測 根據農業部轉基因鑒定方法設計鑒定轉基因標記物的9 對引物bar-QF/bar-QR、 35S-F1/35S-R1、 FMV35S-F1/FMV35s-R1、PONS-F1/PONS-R1、NOS-F1/NOS-R1、T35S-F1/T35S-R1、 NPTF68/NPTR356、 HPTF226/HPTF697、PMIF43/PMIR303，以轉化水稻的pCAMBIAI1305.1：35S∷sm-Ngt1載體質粒DNA 為模板，檢測其可擴增性和最佳復性溫度，擴增體系及反應程序同上，復性溫度在54～62 ℃，以1 ℃為溫度梯度進行PCR 擴增，找出最佳溫度后再進行轉基因材料的擴增。

2 結果與分析

2.1 目的基因sm-Ngt1 的PCR 檢測與分析

將采集的15 個轉基因sm-Ngt1水稻株系連續兩代（T5、T6 代）的劍葉葉片（每個株系取3 個單株作為重復）進行DNA 提取，actin-F/actin-R 擴增檢測材料DNA 質量，結果如圖1 所示。

圖1 轉基因材料DNA 質量

如圖2 所示，用GT-F1/GT-R1 和GT-F2/GT-R2對T6 代進行轉sm-Ngt1基因水稻陽性鑒定，編號2、4、6、10 這4 個株系中無條帶，這表明這4 個株系均為陰性，sm-Ngt1基因沒有插入；編號8 的株系中，3株有1 株無條帶，表明該株系還處于分離狀態；其余轉基因株系均為陽性，sm-Ngt1基因穩定轉入了YTB。

圖2 PCR 鑒定陽性轉基因株系

2.2 轉sm-Ngt1 基因水稻株系與YTB 的農藝性狀對比

轉sm-Ngt1基因水稻株系與受體品種YTB 相比，除了莖稈明顯增粗外，其生長適應性方面無明顯差異。如表3 所示，T6 代轉基因植株（編號1、編號3）的抽穗期、株高、結實率及千粒重與陰性（編號4）及受體YTB 差異均不顯著。

表3 轉sm-Ngt1 基因水稻轉化體與非轉基因對照的農藝性狀對比

2.3 轉sm-Ngt1 基因水稻中轉基因標記物分子檢測

將轉化水稻YTB 用的pCAMBIAI1305.1：35S∷sm-Ngt1載體質粒DNA 作為模板檢測9 對引物的可擴增性和最佳復性溫度，結果如圖3 所示。由圖3 可知，溫度對不同引物的擴增無明顯影響，5 對引物（35S-F1/35S-R1、NOS-F1/NOS-R1、T35S-F1/T35SR1、HPTF226/HPTF697、NPTF68/NPTR356）可以擴增明顯的條帶，說明載體pCAMBIAI1305.1 含有這5種元件。表明pCAMBIAI1305.1：35S∷sm-Ngt1載體質粒可以作為sm-Ngt1植株中不同轉基因原件PCR 鑒定時穩定的對照。

圖3 梯度PCR 檢測引物的最佳復性溫度

用這5 對引物擴增轉sm-Ngt1基因水稻不同株系基因組DNA，結果顯示有3 對引物（NOS-F1/NOSR1、T35S-F1/T35S-R1、NPTF68/NPTR356）在轉基因水稻T5 代和T6 代中都能擴增出特異性條帶（圖4）。2 對引物（35S-F1/35S-R1、HPTF226/HPTF69）在編號2、4、6、10 這4 個株系（T5 和T6）中無條帶，編號8的株系中，3 株T6 中有1 株無條帶，其余株系都有條帶（圖5）。

圖4 PCR 分子標記檢測

圖5 PCR 分子標記檢測

3 小結與討論

外源基因在轉基因受體中的遺傳穩定性受進入受體植株基因組位置的影響，其在轉基因后代中的表達可能受到特異性抑制而出現轉基因沉默。Singh 等［14］和張小紅等［15］對玉米和轉Xa23 基因水稻進行研究發現，外源基因插入受體植物基因組位置不同，其表達水平有明顯的差異。此外，外界環境因素對轉基因植物遺傳穩定性也有影響。蔣佳宏等［16］研究tak基因表達時發現，用光誘導tak基因促進了tak2 基因轉錄，抑制了tak1 基因轉錄。本研究根據sm-Ngt1基因序列設計2 對引物，對連續種植2年的15 個轉sm-Ngt1基因水稻兩代家系的基因組DNA 進行PCR 擴增，結果發現在15 個株系中，編號2、4、6、10 的4 個轉基因家系中無sm-Ngt1基因，編號為8 的家系中含有sm-Ngt1基因但遺傳不穩定，在其余株系中sm-Ngt1基因均能穩定遺傳。

將轉基因用的pCAMBIAI1305.1：35S∷sm-Ngt1載體質粒DNA 作為模板對農業部要求的9 對引物的可擴增性進行檢測，有5 對引物（35S-F1/35S-R1、NOS-F1/NOS-R1、 T35S-F1/T35S-R1、 NPTF68/NPTR356、HPTF226/HPTF6975）能擴增出特異條帶，與pCAMBIAI1305.1 質粒載體各原件相符合。用這5 對引物鑒定15 個轉sm-Ngt1基因株系的轉基因標記 物，有3 對 引 物（NOS-F1/NOS-R1、T35S-F1/T35S-R1、NPTF68/NPTR356）在所有轉基因水稻株系的后代中（T5 代和T6 代）都能擴增出特異性條帶，可能是因為pCAMBIAI1305.1：35S∷sm-Ngt1整合進入受體YTB 基因組時，其T-DNA 未被酶完全切開，導致pCAMBIAI1305.1 載體的NOS基因和NPT基因進入水稻YTB 基因組DNA 中。2 對引物（35SF1/35S-R1、HPTF226/HPTF69）檢測結果與sm-Ngt1檢測結果相同。初步實驗結果得出編號1、3、5、7-9、11-15 的11 個轉基因株系含35S 啟動子和HPT基因，編號8 株系35S 啟動子和HPT基因的遺傳不穩定，其余的10 個株系中的35S 啟動子和HPT基因在后代中均能穩定遺傳。