不同膻味水平的龍陵黃山羊肝組織轉錄組SNP分析

馬 琳，楊 明，王宣懿，葉紹輝

（云南農業大學動物科學與技術學院，昆明 650201）

羊肉在世界各地廣泛食用，但由于其膻味，在許多亞洲國家并不受歡迎。4-甲基辛酸（4-Methyl octanoic acid，MOA）、4-乙基辛酸（4-Ethyl octanoic acid，EOA）和4-甲基壬酸（4-Methyl Nonanoic acid，MNA）［1-3］這3 種化合物是引起羊肉膻味的主要物質，此外還有3-甲基吲哚（3-Methyl indole，MI）和4-甲基苯酚（4-Methyl phenol，MP）［4，5］。龍陵黃山羊（Longling yellow goat，LLG）是產于云南省保山市龍陵縣及周邊的地方品種，其具有體大、屠宰率高、耐粗飼等良種特性［6］。但膻味卻一直制約著龍陵黃山羊的發展。羊的肝臟具有代謝功能，膻味物質的形成需要肝臟參與代謝，進而沉積到脂肪組織中，產生特有的羊膻味。目前龍陵黃山羊的研究主要集中在肉品質、養殖方式、繁殖性能和疾病的研究，鮮見其膻味研究的相關報道。

單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphisms，SNP），是指單個核苷酸的變異而導致的基因多態性，其數量很多，多態性豐富。每個SNP 位點都可以是4 種不同的變異形式（轉換、顛換、插入、缺失），其中轉換和顛換二者之比為2∶1，可能是因為CpG 二核苷酸中5-甲基胞嘧啶（5mC）脫氨基對胸腺嘧啶的高自發率而導致［7］。SNP 在CG 序列上出現最為頻繁，是因為CG 中的C 常被甲基化而轉換成T。SNP 位點極其豐富，幾乎遍及整個基因組。雖然隨著時空的改變轉錄基因種類可能會有些許變化，但轉錄組運用于檢測轉錄區域多態性仍是1 種高效且經濟的方法［8］。該研究旨在通過對龍陵黃山羊肝臟轉錄組SNP 進行分析，探索龍陵黃山羊膻味相關差異基因，為龍陵黃山羊膻味的相關研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇飼養健康的龍陵黃山羊、云嶺山羊（Yunling goat，YLG）和大理綿羊（Dali sheep，DLS）共14只；龍陵黃山羊取自云南省保山市龍陵縣，云嶺山羊和大理綿羊取自云南省大理市賓川縣。

1.2 樣品采集

對試驗山羊采用頸動脈放血處死，快速取其100～150 g 腰部皮下脂肪組織和肝臟組織，分別置于保鮮袋和無酶凍存管中，液氮條件下運回實驗室，分別放入-20、-80 ℃冰箱保存待用。所采集的皮下脂肪組織用于測定致膻物質（MOA、EOA、MNA、MI 和MP）的含量。所采集的肝臟組織用于轉錄組的測序，按提取要求取適量樣本，采用Trizol 法提取RNA，對提取的總RNA 按一定比例進行稀釋。利用NanoPhotometer?分光光度計檢測樣品純度（IMPLEN 公司），Qubit?3.0Flurometer（Life Technologies公司）檢測RNA 樣品濃度，安捷倫2100 RNA Nano 6000 AssayKit（Agilent Tech-nologies 公司）檢測RNA樣品的完整度和濃度。

1.3 膻味值計算

通過氣相色譜法測定致膻物質（MOA、MEA、EOA、MI、MP）5 個指標的含量，然后將致膻物質的含量除以其膻味閾值得到膻味值，再將其膻味值進行加和得到總膻味值。其中膻味閾值是指人們能夠感知該化合物氣味的最小濃度［9］，在pH=2 的介質中MOA 的膻味閾值是0.02 μg/g，MNA 的膻味閾值是0.65 μg/g，EOA 的膻味閾值是0.006 μg/g［9，10］，MI的膻味閾值是0.303 μg/g，MP 的膻味閾值是0.7 μg/g［11，12］。對3 個羊品種的膻味值進行顯著性差異檢驗。

1.4 高通量測序

根據膻味含量測定以及膻味值計算比較后，對挑選出的龍陵黃山羊（6 只）的肝組織進行轉錄組測序。總RNA 樣本檢測合格后，選用帶有Oligo（dT）的磁珠進行富集純化mRNA，向純化得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer 使其片段成為短片段，以片段后的mRNA 為模板，用六堿基隨機引物合成cDNA 第1 鏈，并 加 入 緩 沖 液、dNTPs、RNaseH 和DNA Polymerase Ⅰ合 成cDNA 第2 鏈，經 過QIAQuick PCR 試劑盒純化并加EB 緩沖液洗脫。洗脫純化后的雙鏈cDNA 再進行末端修復、加堿基A、加測序接頭處理，然后經瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段并進行PCR 擴增，從而完成整個文庫制備工作。質量合格的文庫用Illumina 平臺進行測序，測序由北京擎科科技有限公司昆明分公司完成。完成測序和質控的數據被用來與山羊參考基因組ARS1做比對，之后進行SNP 檢測以及GO、KEGG 富集分析。

2 結果與分析

2.1 篩選轉錄組樣本

以14 個樣本總膻味值的平均數（771.845）來分類，高于771.845 膻味值的樣本為高膻味水平組，低于771.845 膻味值的樣本為低膻味水平組，14 個樣本的膻味水平分組如表1 所示。

表1 所有樣本膻味水平分組

對高膻味水平組和低膻味水平組進行差異檢驗發現（表2），云嶺山羊和大理綿羊種內高低膻味水平組無顯著差異（P＞0.05），而龍陵黃山羊種內2 個水平組差異極顯著（P＜0.01），龍陵黃山羊種內高膻味水平和低膻味水平符合轉錄組樣本的要求。

表2 高膻味水平與低膻味水平樣本的差異檢驗

2.2 轉錄組測序結果

對高膻味水平（LLG-H）和低膻味水平（LLG-L）的龍陵黃山羊肝臟組織共6 個RNA 樣品進行測序，結果如表3 所示，經過測序質量控制，共得到40.41 Gb 過濾后的數據，測序樣本的總過濾序列數約為4 490 萬，高質量序列數約為4 132 萬，高質量序列比率約為92.01%，各樣品Q30比率均大于89.00%。這表明測序數據質量良好，可用于后續分析。

表3 龍陵黃山羊肝臟組織轉錄組測序結果

2.3 SNP 檢測

2.3.1 SNP 統計 利用samtools 軟件將經過排序、去PCR 重復后的比對文件同參考序列進行比對，得到每個樣品的SNP 檢測結果（表4）。進一步分析發現，其中LLG-H 特有的SNP（SNPLLG-H）有411 973個，LLG-L 特有的SNP（SNPLLG-L）有444 638 個，LLG-H 和LLG-L 共 有SNP（SNPLLG）856 611 個。根據變異的統計結果，對高膻味水平（LLG-H）和低膻味水平（LLG-L）龍陵黃山羊的SNP 突變類型的分布進行統計（圖1），結果顯示6 種單核苷酸變異中，C/T 和A/G 發生的頻率最高。

圖1 SNP 突變類型

表4 肝臟轉錄組SNP 檢測結果

2.3.2 SNP 所在基因的注釋 利用Omicshare 統計SNPLLG-H、SNPLLG-L 和SNPLLG 3 組的SNP 所在基因的GO 富集情況，結果見圖2，發現SNPLLG-H、SNPLLG-L 和SNPLLG 的SNP 所在的基因參與生物進程、分子功能和細胞組成3 個部分富集比例基本一致。但是SNPLLG-H 的SNP 所在基因在每個功能的富集比例均大于SNPLLG-L 所在基因。

圖2 SNP 所在基因的GO 分析

利用Kobas 對所有SNP 所在基因進行KEGG 富集分析，發現總共有4 073 個基因注釋到339 個通路上。SNP 所在基因顯著富集在磷脂酰肌醇信號系統、補體和凝血級聯、胰島素抵抗、拼接體、自噬-動物、輔因子的生物合成、內質網中的蛋白質加工、胞吞作用、AMPK 信號等通路（圖3）。

圖3 SNP 所在基因的KEGG 分析

2.4 脂肪酸生物合成通路中SNP 功能的生物信息學分析

脂肪酸生物合成是膻味的關鍵來源，動物脂肪細胞中脂肪的合成直接影響脂肪酸的含量，羊肉膻味相關的脂肪酸正是在各種酶的參與調控下發揮作用。乙酸是脂肪酸合成的主要前體物質，在反芻動物瘤胃發酵下可以產生乙酸。在脂肪細胞內，乙酸在酶的作用下合成乙酰輔酶A，然后在乙酰輔酶A羧化酶的催化下形成丙二酸單酰輔酶A，隨后由還原型煙酰氨腺嘌呤二核苷酸磷酸生成酶提供還原氫，脂肪酸合成酶（FASN）催化合成長鏈脂肪酸，之后細胞利用脂蛋白脂酶水解產生的脂肪酸和細胞從頭合成的脂肪酸酯化形成甘油三酯，而激素敏感酯酶則催化甘油三酯水解為甘油和游離脂肪酸（短鏈脂肪酸）［13］。膻味就是由于其產生的短鏈脂肪酸而產生的。

根據KEGG 富集結果，發現共有19 個含SNP 的基因富集到脂肪酸生物合成通路，從其中隨機挑選6 個有SNP 的基因進行生物信息學分析，結果見表5。由表5 可知，6 個基因中共有7 個SNP 位于同義編碼（SYNONYMOUS_CODING）區域，利用Editseq將含有SNP 的SYNONYMOUS_CODING 區域序列翻譯為氨基酸，與原氨基酸序列進行比對，發現2 個SNP 引起了氨基酸的改變，FASN、ACACA基因為沉默突變，ACSL3基因為沉默突變、無義突變和錯義突變，其中ACSL3基因上的SNP 在高膻味水平和低膻味水平的龍陵黃山羊都有表現，ACSL6基因上的SNP 是低膻味水平龍陵黃山羊特有，但是其氨基酸沒有改變，FASN、ACACA基因上的SNP 為高膻味水平龍陵黃山羊所特有。

表5 脂肪酸生物合成通路SNP 功能的生物信息學分析

3 小結與討論

轉錄組測序廣泛應用于定量基因表達和非注釋轉錄本的鑒定，作為生物學信息的來源，可用于鑒定導致復雜性狀變異的原因［14］。除此之外，也有研究表明利用轉錄組測序進行SNP 的篩選是可行的［15］。使用轉錄組測序技術大大降低了試驗成本，并且獲得的數據反映了基因表達，這是最基本的分子表型。轉錄組測序還能夠在特定基因座處提供較高的深度，能夠發現高表達基因中的偶發等位基因［16，17］。

該研究發現，6 種單核苷酸變異中，以C/T 和A/G 發生頻率最高，這與轉換突變發生頻率高于顛換的結果相符合。通過對SNPLLG-H、SNPLLG-L、SNPLLG 的SNP 所在基因進行GO 富集，發現SNPLLG-H 的SNP 所在基因在每個功能的富集比例均大于SNPLLG-L 的SNP 所在基因。SNPLLG-H 的SNP 所在基因顯著富集在核體、細胞器內膜、細胞-基底粘附體結、細胞質、胞內膜-有界細胞器、細胞外空間、嘌呤核糖核苷結合、過渡金屬離子結合、核糖核酸結合、泛素樣蛋白連接酶結合、磷酸酶結合、谷胱甘肽過氧化物酶活性的調節、囊泡介導的轉運、脂肪酸代謝過程、內皮細胞遷移的調節、膽固醇代謝過程等類別，SNPLLG-L 的SNP 所在基因顯著富集在胞內膜-有界細胞器、細胞外區域、核腔、細胞質、細胞-基底粘附體結、細胞外空間、膜、核糖核酸結合、蛋白結合、陽離子結合、過渡金屬離子結合、嘌呤核糖核苷結合、激酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白轉移酶活性、磷酸酶結合、谷胱甘肽過氧化物酶活性的調節、修飾依賴性蛋白質分解代謝過

程、活性氧代謝過程、內胚層形成、細胞連接組件等類別。兩組SNP（SNPLLG）所在基因富集在不同的生物功能，可能與龍陵黃山羊的膻味有關，龍陵黃山羊支鏈脂肪酸的產生導致羊膻味的發生。而膻味相關基因究竟是如何影響其膻味的，還需要進一步研究。

研究表明，ACACA、FASN是脂肪酸從頭合成的關鍵限速酶，在細胞之類代謝過程以及脂肪酸生物合成中起重要調控作用，FASN表達模式雖有差異但其表達水平與脂肪含量都顯著正相關［18］，其表達受到多種激素的調控，當其表達上調時，能增加膻味的產生［19］。ACSL基因家族成員中不同成員在不同組織中有著不同的作用和表達，暗示了每種ACSL成員可能在特定的組織中發揮著不同的特定作用，ACSL6往往會促進長鏈多不飽和脂肪酸的產生［20］，而支鏈脂肪酸是膻味的來源，ACSL6可能會抑制短鏈脂肪酸的生成，因此可能會降低羊的膻味［21］。該研究通過對SNP 所在基因KEGG 富集發現，SNP 所在基因顯著富集在在磷脂酰肌醇信號系統、補體和凝血級聯、胰島素抵抗、拼接體、自噬-動物、輔因子的生物合成、內質網中的蛋白質加工、胞吞作用、AMPK 信號等通路。從與膻味相關的脂肪酸生物合成通路中隨機挑選出6 個含SNP 的基因，發現6 個基因中，有2 個基因的SNP 導致了氨基酸的改變，其中ACSL3基因上的SNP 在高膻味水平和低膻味水平的龍陵黃山羊都有表現，ACSL6基因上的SNP 存在于低膻味水平的龍陵黃山羊，而FASN、ACACA基因上的SNP 為高膻味水平龍陵黃山羊特有。因此，ACSL6基因的變異可能會降低龍陵黃山羊的膻味，而FASN、ACACA基因的變異可能與龍陵黃山羊的高膻味有關。