京山地區(qū)對節(jié)白蠟與“京翠”親緣關(guān)系的cpSSR 分析

金宇晨，柴隆龍，馬 倩，熊燕飛，張建坤，陳碧峰

（1.武漢理工大學化學化工與生命科學學院，武漢 430014；2.湖北森寶園藝有限公司，湖北 荊門 431815）

對節(jié)白蠟（Fraxinus hupehensis），又名湖北梣、湖北白蠟，是木犀科梣屬落葉大喬木，樹皮深灰色，老時縱裂；營養(yǎng)枝常呈棘刺狀。喜光，稍耐寒，耐干旱、瘠薄，適應性強。產(chǎn)自中國湖北京山等地，北京等地也有栽培。對節(jié)白蠟生長緩慢，壽命長，樹形優(yōu)美，盤根錯節(jié)，是園林、盆景、根雕家族中的極品，被譽為“活化石”和“盆景之王”［1］。

2013 年在對節(jié)白蠟天然種群中發(fā)現(xiàn)1 株冠形緊湊、樹形優(yōu)美的品種，經(jīng)中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所鑒定為新品種，命名為“京翠”。與對節(jié)白蠟相比，“京翠”具有葉色翠綠，葉片大，樹冠緊湊，樹型優(yōu)美，無需修剪，自然成型的特點。從2014 年開始，湖北省京山市林業(yè)局就開展了“京翠”品種繁育推廣試驗。經(jīng)過5 年的試驗，形成了較為成熟的“京翠”品種繁育推廣技術(shù)［2］。

為探索對節(jié)白蠟與“京翠”的遺傳距離和遺傳一致性，采用葉綠體微衛(wèi)星（Chloroplast microsatellite，cpSSR）分子標記技術(shù)對“京翠”和對接白蠟展開研究，并對其他物種的相關(guān)cpSSR 數(shù)據(jù)進行了匯總分析，旨在從分子水平上揭示兩者的親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的對節(jié)白蠟和“京翠”樣本均取于湖北省京山市虎爪山林場。依據(jù)隨機取樣原則，在對節(jié)白蠟和“京翠”的居群內(nèi)隨機挑選3 棵胸徑30 cm 以上成熟的大樹（相距10 m 以上），每棵樹上采集20～30 g當年生嫩葉，置于冰盒內(nèi)冷藏保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取 采用TIANGEN 公司的DNAsecure 新型植物基因組DNA 提取試劑盒（DNAsecure Plant Kit，DP320-02），取100 mg 樣本幼葉組織，經(jīng)液氮冷凍研磨成粉末后，根據(jù)試劑盒說明書提取DNA。

1.2.2 cpSSR 引物合成 cpDNA 相對保守，cpSSR突變率較低，故cpSSR 引物的通用性較高。本研究選取22 對通用cpSSR 引物［3，4］用于節(jié)白蠟和“京翠”基因組DNA 的PCR 擴增（表1），22 對引物均由武漢生工生物公司合成。

表1 22 對cpSSR 引物序列

1.2.3 cpSSR-PCR 反應體系和擴增程序 cpSSRPCR 反應體系為0.1 μL Taq 酶、2 μL Taq 酶buffer、1 μL cpSSR primer（上游+下游）、1.5 μL 模版DNA（20 ng/μL）、10.2 μL RNase-Free Water、0.2 μL dNTP，反應總體系為15 μL。由于引物退火溫度的差異，為22 對cpSSR 引物優(yōu)化出2 套PCR 擴增程序（表2）［5］。反應結(jié)束后PCR 產(chǎn)物置于4 ℃保存，待凝膠電泳檢測。

表2 22 對cpSSR 引物的PCR 擴增程序

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 在電泳圖譜中，同一位置的條帶被視作1 個位點，根據(jù)同一位置上是否有條帶進行統(tǒng)計，有帶的記為“1”，無帶記為“0”。以對節(jié)白蠟的條帶為標準，記錄數(shù)據(jù)結(jié)果。利用軟件POPGENE1.31 計算樣本數(shù)據(jù)的遺傳一致度及遺傳距離。利用NTSYS-pc2.10 軟件根據(jù)居群間的Nei's 遺傳一致度，對樣本數(shù)據(jù)及其他物種的相關(guān)cpSSR 的標準數(shù)據(jù)進行UPGMA 聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 cpSSR-PCR 擴增產(chǎn)物檢測

對節(jié)白蠟和“京翠”基因組DNA 經(jīng)22 對cpSSR引物進行PCR 擴增后，產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1 所示。對“京翠”與對節(jié)白蠟的3 對樣本分別進行cpSSR-PCR 擴增試驗，凝膠電泳結(jié)果均一致。引物擴增結(jié)果特異性強，條帶清晰且單一，擴增片段主要集中在100～500 bp，與預測產(chǎn)物條帶大小的范圍一致［6］。

圖1 對節(jié)白蠟和“京翠”基因組PCR 擴增后產(chǎn)物的凝膠電泳

2.2 遺傳一致度和遺傳距離

該研究共提取了ccmp1—ccmp10 引物在其他物種中的試驗數(shù)據(jù)，與對節(jié)白蠟和“京翠”的試驗數(shù)據(jù)進行匯總分析，對節(jié)白蠟、“京翠”及其他物種間的遺傳一致度和遺傳距離的結(jié)果如表3 所示。由表3 可知，對節(jié)白蠟、“京翠”及其他物種間的Nei's 遺傳距離值范圍為0.066 8～0.916 3，遺傳一致度范圍為0.250 0～0.933 3，說明所選物種之間特異性明顯，條帶差異大。其中“京翠”與對節(jié)白蠟的遺傳一致度為0.461 5，遺傳距離為0.602 0，說明兩者的遺傳一致度較高，但兩者間的遺傳距離較大。此外，對22 對cpSSR 引物擴增后的凝膠電泳圖譜結(jié)果進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，對節(jié)白蠟和“京翠”的遺傳一致度為0.454 5，遺傳距離為0.788 5，該結(jié)果與10 對引物（ccmp1—ccmp10）計算結(jié)果一致。

表3 對節(jié)白蠟、“京翠”及其他物種間的遺傳一致度和遺傳距離

2.3 cpSSR 遺傳聚類分析

基于ccmp1—ccmp10 引物擴增結(jié)果分析得到的遺傳一致度，對上述物種進行UPGMA 遺傳關(guān)系聚類分析，結(jié)果如圖2 所示。從聚類圖可以看出，對節(jié)白蠟、“京翠”和其他物種共同聚成5 個大類：第Ⅰ類包括“京翠”和豆科；第Ⅱ類為對節(jié)白蠟、茄科、獼猴桃科、薔薇科和桃金娘科；龍舌蘭科、禾本科和十字花科分別歸屬于第Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ類。

圖2 不同物種間的UPGMA 遺傳關(guān)系聚類結(jié)果

3 小結(jié)與討論

“京翠”自2018 年被培育出來，其與對節(jié)白蠟之間的親緣關(guān)系鮮有研究。葉綠體微衛(wèi)星（cpSSR）是1 種新型的標記技術(shù)，目前已被廣泛應用到植物種群遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)分析、種群分類、系統(tǒng)地理分布等方面研究。由于微衛(wèi)星（SSR）兩側(cè)的堿基序列具有很強的保守性［7］，因此1 個引物可以在另外1個物種上進行穩(wěn)定擴增，稱之為“種間擴增”［8］。而cpSSR 不僅有SSR 的優(yōu)點，還能兼顧到cpDNA 獨立進化的特點，可以通過設計特異引物，對物種的葉綠體DNA 進行PCR 擴增，擴增片段的長度多態(tài)性可用作分子標記。采用cpSSR 分子標記方法，首次從分子水平上揭示對節(jié)白蠟和“京翠”的親緣關(guān)系，為對節(jié)白蠟和“京翠”之間的發(fā)育進化關(guān)系提供科學依據(jù)。

本研究中，首先選用了10 對通用cpSSR 引物對對節(jié)白蠟和“京翠”樣本的總基因組DNA 進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)“京翠”與對節(jié)白蠟的遺傳一致度為0.461 5，遺傳距離為0.602 0。這10 對cpSSR 引物的PCR 擴增試驗數(shù)據(jù)建立聚類圖譜發(fā)現(xiàn)，薔薇科與桃金娘科聚在同一支上，并且遠離龍舌蘭科和禾本科，豆科和十字花科之間的距離則相對較遠。對節(jié)白蠟與“京翠”的親緣關(guān)系并不近，可能是該研究的cpSSR 位點數(shù)量不足，不能充分評估對節(jié)白蠟與“京翠”之間的親緣關(guān)系。

此外，利用22 對引物重新對對節(jié)白蠟和“京翠”的基因組總DNA 樣本進行擴增，對凝膠電泳獲取實驗數(shù)據(jù)進行遺傳一致性和遺傳距離分析發(fā)現(xiàn)，2 者的遺傳距離和遺傳一致性未發(fā)生較大改變。綜合分析，對節(jié)白蠟與“京翠”之間確實存在親緣關(guān)系，但2者的親緣性并不大。考慮到對節(jié)白蠟不同居群之間存在較大的遺傳多樣性［9］，后續(xù)的研究還需納入更多不同的對節(jié)白蠟居群樣本，以及野生“京翠”植株的樣本，進行更精細的種內(nèi)比對。同時分子標記技術(shù)具有擴增條帶統(tǒng)計誤差較大等缺點，在今后研究中，需采取多種分子標記技術(shù)進行綜合比較分析，才能更加全面、準確地解析對節(jié)白蠟與“京翠”之間的親緣關(guān)系。