不同檢測方法對鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌的鑒定結(jié)果比較及同源性分析*

趙智龍，姚汶藝，宮海燕，史 松

新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.營養(yǎng)科；3.醫(yī)務(wù)部，新疆烏魯木齊 830011

對臨床分離的病原菌進(jìn)行精確、快速的鑒定是抗感染治療的主要途徑，針對病原菌科學(xué)使用抗菌藥物，可有效控制耐藥菌的產(chǎn)生與傳播，降低醫(yī)療成本與病死率。隨著抗菌藥物的廣泛使用及病原菌的變異，傳統(tǒng)的細(xì)菌生化鑒定法已經(jīng)無法滿足臨床耐藥菌診治的發(fā)展需求。熒光雜交和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定方法較為準(zhǔn)確，但成本昂貴且費(fèi)時(shí)，不適用于臨床標(biāo)本的常規(guī)鑒定[1- 2]。近年來，基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)通過樣品制備、蛋白提取、圖譜分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)評價(jià)等步驟，可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌屬、種、亞種乃至株水平上的準(zhǔn)確快速鑒定[3]。MALDI-TOF MS已被廣泛應(yīng)用于臨床病原菌的快速鑒定，該方法快速、高效，可為臨床治療提供有效的幫助[4]。由于細(xì)菌在不同地域存在一定差異，對本地菌株進(jìn)行不同方法學(xué)的鑒定比較，可有效提高臨床病原菌的鑒定水平。因此，本研究比較MALDI-TOF MS與細(xì)菌生化鑒定兩種方法對臨床常見病原菌鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌的鑒定差異，并進(jìn)行同源性分析，旨在為臨床抗感染治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院2019年3-4月從臨床標(biāo)本分離出的40株鮑曼不動桿菌敏感菌株、40株大腸埃希菌敏感菌株。

1.2儀器與試劑 MALDI-TOF MS所用甲酸(美國賽默飛世爾科技公司，批號：151817)、乙腈(美國賽默飛世爾科技公司，批號：167900)、α-氰-4-羥基肉桂酸(美國賽默飛世爾科技公司，批號：SHBD0586V)、三氟乙酸(美國賽默飛世爾科技公司，批號：153080)、無水乙醇(美國賽默飛世爾科技公司，批號：159116)均為色譜純，購自Fisher Chemical。培養(yǎng)基為含5%～10%羊血的營養(yǎng)瓊脂(中國北京陸橋技術(shù)有限公司)，標(biāo)準(zhǔn)菌株為大腸埃希菌ATCC8739。質(zhì)譜儀Clin-TOF Ⅱ型基質(zhì)輔助激光解析/飛行時(shí)間質(zhì)譜(中國北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司)，VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)。數(shù)據(jù)采集軟件為Shimadzo Biotech MALDI-MS 2.9.3(中國北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司)，微生物鑒定軟件及聚類分析軟件均為MicroID version 4.0(中國北京鑫匯普瑞公司)，測序反應(yīng)試劑盒為Big-dye試劑盒(美國ABI公司)，Taq酶采用TaqHotStart DNA Polymerase(日本Takara公司)，擴(kuò)增儀為Verity PCR儀擴(kuò)(美國ABI公司)，測序采用3730XL測序儀(美國ABI公司)。

1.316S rRNA測序 引物序列根據(jù)基因序列信息，采用的Primer5.0軟件由北京博云輝科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，F(xiàn)：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，R：GGTTACCTTGTTACGACTT；采用Big-dye試劑盒的25 μL反應(yīng)體系,預(yù)變性95 ℃ 300 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù):95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s，然后72 ℃ 300 s保溫。16S rRNA測序結(jié)果，采用NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)進(jìn)行比對鑒定，采用mega7.0進(jìn)行同源性分析。

1.4MALDI-TOF MS鑒定 標(biāo)準(zhǔn)菌株和待檢菌株均提取蛋白后用于鑒定。用接種環(huán)取菌落約5 mg，置于盛有300 μL純水的1.5 mL離心管中，振蕩均勻。向離心管中加入900 μL無水乙醇，振蕩，用漩渦儀混勻3～5 s。混合后用離心機(jī)以12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，再次以12 000 r/min離心2 min，吸棄剩余液體，置于室溫干燥5 min。加入40 μL 70%甲酸，充分振蕩，漩渦儀混勻3～5 s，之后再加入40 μL乙腈，充分振蕩，漩渦儀混勻3～5 s，用離心機(jī)以12 000 r/min離心2 min后，用移液槍吸取1 μL上清液點(diǎn)到靶板上，待室溫干燥后加1 μL基質(zhì)溶液覆蓋在樣品點(diǎn)上，室溫條件下自然晾干。標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC8739作為質(zhì)量控制，將金屬靶板放入儀器中檢測。為確保細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性，最大化降低系統(tǒng)誤差和人工操作誤差，同一株菌由3名人員分別提取蛋白樣品檢測。鑒定時(shí)，同一株菌每名人員點(diǎn)靶24個(gè)位點(diǎn)，共72個(gè)位點(diǎn)。MALDI-TOF MS采集細(xì)菌肽質(zhì)量譜，所用參數(shù)如下：激光頻率40 Hz，激光能量64%，選擇線性正離子模式。采集分子量為2 000～20 000的肽質(zhì)量譜。每個(gè)標(biāo)本的肽質(zhì)量譜在不同位置經(jīng)過500次激光點(diǎn)擊獲得。首先利用標(biāo)準(zhǔn)菌株的特征峰數(shù)據(jù)對設(shè)備進(jìn)行分子量校準(zhǔn)，然后再將待測菌株的數(shù)據(jù)與MicroID 4.0數(shù)據(jù)庫中的圖譜進(jìn)行比對，然后給出相應(yīng)的分值，并得出鑒定結(jié)果。蛋白質(zhì)特征圖譜采用MicroID 4.0進(jìn)行相似度比對；MALDI-TOF MS結(jié)果和VITEK-2 Compact全自動細(xì)菌鑒定儀結(jié)果分別與16S rRNA進(jìn)行比較：(1)一致即判定為鑒定正確；(2)不一致即判定為鑒定錯(cuò)誤；(3)未鑒定出結(jié)果，即判定為失敗鑒定。

1.5細(xì)菌生化鑒定 采用VITEK-2 Compact全自動細(xì)菌鑒定儀對標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MALDI-TOF MS與細(xì)菌生化鑒定的結(jié)果比較

2.1.1細(xì)菌生化鑒定 采用VITEK-2 Compact全自動細(xì)菌鑒定儀從臨床標(biāo)本中分離出40株鮑曼不動桿菌待測菌、40株大腸埃希菌待測菌。

2.1.2鮑曼不動桿菌鑒定比較 將16S rRNA基因測序結(jié)果通過NCBI進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，通過細(xì)菌生化鑒定出的40株鮑曼不動桿菌待測菌中有19株鮑曼不動桿菌，21株非鮑曼不動桿菌；MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果為鮑曼不動桿菌19株、皮特不動桿菌12株、醫(yī)院不動桿菌3株、抗輻射不動桿菌2株，4株未鑒定出。除4株未鑒定出的標(biāo)本，MALDI-TOF MS對其余菌株的鑒定結(jié)果與16S rRNA基因測序結(jié)果一致性較好(90.00%)。細(xì)菌生化鑒定結(jié)果顯示，40株待測菌均為鮑曼不動桿菌，與16S rRNA基因測序的鑒定結(jié)果的一致性較差(47.50%)。

2.1.3大腸埃希菌鑒定比較 將16S rRNA基因測序結(jié)果通過NCBI進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，40株通過細(xì)菌生化鑒定出的大腸埃希菌待測菌均為大腸埃希菌；MALDI-TOF MS、細(xì)菌生化鑒定與16S rRNA基因測序的鑒定結(jié)果一致(100.00%)。

2.1.4基于鑒定結(jié)果的判別比較 對兩組儀器鑒定方法結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行比較，對鮑曼不動桿菌的鑒定差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對大腸埃希菌的鑒定差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MALDI-TOF MS有4株失敗鑒定結(jié)果，細(xì)菌生化鑒定無失敗鑒定結(jié)果，細(xì)菌生化鑒定有21株鑒定錯(cuò)誤結(jié)果，均是對鮑曼不動桿菌復(fù)合菌無法進(jìn)行辨別鑒定，見表1。

表1 MALDI-TOF MS與細(xì)菌生化鑒定的結(jié)果比較(n)

2.2鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌的MALDI-TOF MS譜圖與聚類分析 將通過16S rRNA基因測序篩選出的鮑曼不動桿菌(19株)、大腸埃希菌(40株)的譜圖，采用MALDI-TOF MS法采集特征峰譜圖，獲得的譜圖顯示，鮑曼不動桿菌都有m/z4244、m/z4257、m/z5746、m/z8485、m/z8510峰；大腸埃希菌都有m/z4364、m/z4497、m/z4613、m/z5095、m/z5116、m/z5339、m/z5402、m/z5611、m/z6275、m/z6410、m/z6507、m/z7158、m/z7870、m/z9065、m/z9742峰。

2.3同源性分析 采用MicroID 4.0對鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌的特征圖譜進(jìn)行相似度比對，結(jié)果用樹狀圖表示(圖1、2)，其中橫坐標(biāo)表示的百分比越小，圖譜同源性越差。從同源性樹狀圖可以看出，除了B5號菌株同源性較差外，鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌大多數(shù)同源性在70%以上，基本可以歸為同一菌種。采用mega7.0對篩選出的鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌的16S rRNA結(jié)果進(jìn)行同源性分析。其中鮑曼不動桿菌同源性達(dá)96.36%(圖3)，大腸埃希菌同源性達(dá)到94.92%(圖4)。基于質(zhì)譜的特征圖譜和分子生物學(xué)的同源性分析，可以看出兩種分析方式得出的同源性存在一定的差異。質(zhì)譜的特征圖譜的相似度比對，鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌大多數(shù)同源性在70%以上。16S rRNA測序的基因序列比對所得的同源性分析，鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌大多數(shù)同源性在95%以上。不同的方法學(xué)，對于同源性的百分比范圍有所差異，但在相應(yīng)的范圍可評價(jià)菌種之間的同源性情況。

圖1 鮑曼不動桿菌質(zhì)譜圖的聚類圖

圖2 大腸埃希菌質(zhì)譜圖的聚類圖

圖3 鮑曼不動桿菌16S rRNA的同源性樹狀圖

圖4 大腸埃希菌16S rRNA的同源性樹狀圖

3 討 論

通過對鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行比較，MALDI-TOF MS與細(xì)菌生化鑒定在對鮑曼不動桿菌的正確鑒定上存在一定的差異，MALDI-TOF MS的正確鑒定率高于細(xì)菌生化鑒定。16S rRNA基因測序與MALDI-TOF MS鑒定鮑曼不動桿菌的一致性為90.00%，與生化鑒定的一致性為47.50%；對于大腸埃希菌，16S rRNA基因測序與MALDI-TOF MS鑒定、生化鑒定的一致性均為100.00%。基于質(zhì)譜的特征圖譜和分子生物學(xué)的同源性分析進(jìn)行比較，同源性存在一定的差異，但在相應(yīng)的范圍仍可評價(jià)菌種之間的同源性情況。總體來說，MALDI-TOF MS對鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性較高，鑒定能力較強(qiáng)，對臨床感染的診斷具有一定的鑒定價(jià)值。

目前，建立在細(xì)菌形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生理和生化基礎(chǔ)上的傳統(tǒng)鑒定方法是臨床微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定細(xì)菌的主要方法。傳統(tǒng)的生化鑒定有易操作、耗材便宜等特點(diǎn)，但也存在報(bào)告時(shí)間較長、結(jié)果的準(zhǔn)確性依賴于操作人員的技術(shù)水平、無法及時(shí)準(zhǔn)確地向臨床反饋結(jié)果等不足[5]。隨著核酸技術(shù)發(fā)展，序列測定被用于細(xì)菌精準(zhǔn)鑒定，但仍有鑒定周期長、對實(shí)驗(yàn)室及操作人員有著極高的要求等特點(diǎn)。而近年來質(zhì)譜鑒定技術(shù)的興起，開啟了細(xì)菌鑒定的新時(shí)代，微生物工作者們開始從蛋白質(zhì)水平對微生物進(jìn)行鑒定。MALDI-TOF MS可以很好地彌補(bǔ)生化鑒定的不足，適合大批量標(biāo)本的鑒定，快速報(bào)告結(jié)果，將傳統(tǒng)方法的報(bào)告時(shí)間從2～4 d縮短到幾個(gè)小時(shí)[6]。本研究將細(xì)菌生化鑒定和MALDI-TOF MS結(jié)果與更加精確的測序法進(jìn)行對比，可以看出，MALDI-TOF MS的穩(wěn)定性和一致性比傳統(tǒng)的細(xì)菌生化鑒定更好。對于傳統(tǒng)細(xì)菌生化鑒定無法區(qū)分的相似菌種，諸如鮑曼不動桿菌復(fù)合菌的鑒定，MALDI-TOF MS就可以很好地對其進(jìn)行區(qū)分，其分辨率與16S rRNA基因測序基本一致。

受不同地區(qū)氣候、環(huán)境、經(jīng)濟(jì)等因素的影響，質(zhì)譜特征峰會有些許差別，由此會導(dǎo)致某些菌株鑒定失敗。通過建立本地區(qū)細(xì)菌菌株的特征圖譜，可以有效避免因地區(qū)差異造成的鑒定失敗，并及時(shí)準(zhǔn)確地向臨床報(bào)告鑒定結(jié)果[7-8]。此外，為了實(shí)現(xiàn)最佳匹配，提高其分型鑒定能力，需要足量的病原菌構(gòu)建本地區(qū)菌株數(shù)據(jù)庫。隨著對生物標(biāo)簽的廣泛研究和圖庫數(shù)據(jù)庫的不斷完善，MALDI-TOF MS得到了廣泛的應(yīng)用[9-10]。研究表明，在對多種細(xì)菌感染的鑒定中，需實(shí)行傳統(tǒng)技術(shù)、流程以避免漏檢，并應(yīng)用聯(lián)合檢測方法進(jìn)行相互補(bǔ)充，以優(yōu)化流程和提升鑒定能力[11-12]。