高通量測序在乳腺癌及婦科惡性腫瘤篩查中的應用進展*

李 敏，豆小文 綜述,張秀明△ 審校

1.安徽理工大學醫學院，安徽淮南 232000；2.深圳市羅湖區人民醫院醫學檢驗科，廣東深圳 518001

乳腺癌(BC)及婦科惡性腫瘤(如子宮頸癌、輸卵管腫瘤、子宮內膜癌和絨毛膜癌等)是遺傳和獲得性突變、轉錄偏差和表觀遺傳因素影響的基因組改變的結果[1-6]。了解BC及婦科惡性腫瘤的基因組和分子基礎對發現用于篩查和預防的生物標志物及開發更有效的藥物靶點治療策略至關重要。運用傳統的Sanger測序技術(即第一代測序技術)分析實體腫瘤的遺傳表征僅涉及小且單一的DNA片段分析，對于同時進行多個基因的測序是有限、耗時且昂貴的[7]。高通量測序技術(NGS)又稱“下一代”測序技術，允許在一次分析中同時對數千至數百萬個DNA片段進行測序，從而擴大了所獲取的遺傳信息數量，減少了分析的時間和成本[8]。在BC及婦科惡性腫瘤中，NGS的使用在高風險遺傳基因的識別等方面產生了重要的作用[9]，本文就NGS對BC及婦科惡性腫瘤的早期篩查和預防、診斷和治療策略等方面的影響作一綜述。

1 NGS平臺

目前，瑞士羅氏公司的454 測序儀、美國Ⅰllumina公司的Solexa基因組分析儀和ABI公司的SOLiD 測序儀為NGS平臺的代表。

1.1454測序儀 454測序儀運用焦磷酸測序方法即結合乳液聚合酶鏈反應和皮升級焦磷酸為基礎方法，依靠生物發光進行基因測序。其原理是在DNA聚合酶、熒光素酶、腺苷三磷酸(ATP)硫酸化酶和雙磷酸酶的協同作用下，將每一個脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的聚合與一次熒光信號偶聯起來，通過檢測熒光信號的有無和強弱，進行實時檢測DNA序列[10-11]。454焦磷酸測序技術不需要進行電泳，也不需要熒光標記的引物或核酸探針，具有靈敏度高、分析速度快和自動化等優點。

1.2Solexa基因組分析儀 Solexa基因組分析儀運用單分子陣列，通過邊合成邊測序技術檢測DNA序列。其原理是將已加入接頭的DNA片段附著到含接頭測序芯片表面，經過延伸和橋式擴增后，在芯片上形成了數以億計的核苷酸片段，每組核苷酸片段是具有數千份相同模板的單分子簇。通過檢測帶熒光基團的4種特殊dNTP加入到引物后釋放出的焦磷酸鹽信號來確定DNA序列[12-13]。邊合成邊測序技術可減少因二級結構而造成的片段缺失，具有高通量、高靈敏度、自動化、操作簡單等優點。

1.3SOLiD 測序儀 SOLiD測序儀運用寡核苷酸連接測序技術進行“雙堿基”DNA測序。其原理是在連接反應體系中，將5′端帶有4種熒光染料(CY5、Texas Red、CY3、6-FAM)的8堿基探針混合物與目標DNA模板按堿基互補配對原則配對連接，通過發出的熒光信號檢測DNA序列。另外，8堿基DNA探針的3′端第1、2位構成的堿基對編碼表達熒光染料基因，第3～5位是隨機堿基，第6～8位為可以和任何堿基配對的特殊堿基[14-15]。在反應過程中，SOLiD測序儀記錄第1、2位編碼區熒光顏色信息，并用化學法去掉第6～8位堿基及熒光基團，依次循環組成原始顏色序列。SOLiD“雙堿基”DNA測序可用于判斷檢測位點是否為單核苷酸多態性，具有無可匹及的準確性、高通量、系統靈活、操作簡單等優點。

2 NGS篩查BC及婦科惡性腫瘤

目前，NGS在BC及婦科惡性腫瘤的臨床篩查方面應用較少，但其在發現藥物治療新靶點及耐藥的分子機制方面具有重大意義，是臨床研究的熱點之一。

2.1NGS在BC中的應用 BC病理組織形態較為復雜，分型分類眾多。根據基因表達譜，BC可分為腔型A型、腔型B型、人表皮生長因子受體2(HER2)陽性型、基底細胞樣型、未能分類型[16-18]；按免疫組化結果可分為雌激素受體(ER)/孕激素受體(PR)陽性、HER2陽性和三陰性BC(ER、PR、HER2均陰性)，大致對應的基因表達譜分型為：腔型A型和B型、HER2陽性型、基底細胞樣型。因此，可利用NGS對不同分型的BC患者進行基因測序，協助臨床醫生實現疾病的早篩、及時調整治療方案。HAN等[19]研究結果表明，NGS可檢測包括乳腺癌1號基因(BRCA1)啟動子區域缺失以及單核苷酸變異和小的插入、缺失在內的大多數基因重排，并通過仔細評估患者的病史、RNA測序和基因表達，證明了啟動子區域缺失的重要性。BRCA1啟動子區域的缺失顯著，可將其納入遺傳性乳腺癌-卵巢癌綜合征患者的遺傳篩查。NASSAR等[20]利用NGS檢測BC體細胞基因突變，結果表明，除之前已報道的TP53、PIK3CA、PTEN等常見基因外，還發現了KRAS、STK11、APC、JAK3等其他基因的突變。可見，NGS是評估BC癌基因和抑癌基因突變狀態的一個非常有用的工具。

2.2NGS在宮頸癌中的應用 宮頸癌是發病率最高的婦科惡性腫瘤，其早期篩查以高危型人乳頭瘤病毒(HPV)檢測聯合液基薄層細胞學檢測(TCT)為主[21-23]。攜帶高危型HPV但不罹患宮頸癌的女性也并非少數。對于宮頸癌患者來說，NGS可獲得其免疫治療標志物信息；對于高危型HPV攜帶者來說，可預測病毒是否會持續感染、是否會進一步發展為宮頸癌。FERTEY等[24]利用NGS檢測高危型HPV16 L1基因組中胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點(CpG)5962的甲基化水平，證明該位點的甲基化可能是HPV持續感染的預測標志物，且特異性CpG的甲基化與高危病毒載量之間存在相關性。有研究利用NGS觀察到顯著的APOBEC基因突變模式，并證實了SHKBP1、ERBB3、CASP8、HLA-A和TGFBR2是宮頸癌新的顯著突變基因[2]；在所有HPV18陽性患者和76%的HPV16陽性患者中發現HPV整合，可能與結構畸變和靶基因表達水平增高有關。上述有關甲基化檢測以及HPV整合位點分析的研究有望對高危型HPV進一步分型，并揭示了宮頸癌新的潛在治療靶點。

2.3NGS在卵巢癌中的應用 卵巢癌是病死率極高的一種疾病，在疾病早期患者通常無明顯癥狀，在出現臨床癥狀時病情往往已處于晚期階段。約70%的卵巢癌為卵巢高級別漿液性腺癌，此類卵巢癌很少原發于卵巢，而大部分發源于輸卵管[25-27]。目前雖采用糖類抗原125檢測聯合盆腔超聲對散發的卵巢癌進行篩查，但無法實現早期診斷。對于家族性的卵巢癌，通過基因檢測可使患者在尚未發病時就預防性切除卵巢[20]。此外，ZHENG等[28]運用NGS在化療敏感和不敏感卵巢癌患者中鑒定出249個差異表達基因，這些與化療敏感性相關的關鍵基因表達水平可以作為預測治療結果和改善預后的靶點。

2.4NGS在子宮內膜癌中的應用 子宮內膜癌的篩查及診斷方法有血清學檢測、影像學檢查、組織病理學檢測等，但高危子宮內膜癌患者多合并有肥胖，增加了活檢的難度[29-31]。隨著分子生物學技術的發展，組織病理學檢測與基因檢測相結合的方式有望實現子宮內膜癌的臨床早期篩查，并發現基因突變的子宮內膜癌患者。WILSON等[32]研究發現ARID1A、PIK3CA兩種基因同時突變與子宮內膜癌的發生直接相關。SANGTANI等[33]收集從子宮內膜癌患者使用過的陰道衛生棉條上脫落的DNA，采用低覆蓋全基因組測序評估拷貝數、焦磷酸測序測量啟動子甲基化水平，通過NGS確定了19個與子宮內膜癌相關的基因突變，其靈敏度為92%，特異度為86%，為子宮內膜癌非侵襲性且精確的檢測方法提供了依據。

2.5NGS在絨毛膜癌中的應用 相較于上述3種常見的婦科惡性腫瘤，絨毛膜癌發病率雖較低，但其預后不良，易通過血行轉移至其他組織器官，導致患者死亡。并且其診斷方法僅為影像學檢查、病理組織學檢測等，無法實現早期無創篩查，因此，針對絨毛膜癌的基于NGS的基因突變研究逐漸開展起來。高達20%的完全性葡萄胎可發展為妊娠滋養細胞癌，其中就包括絨毛膜癌。目前尚無成熟的生物標志物能夠預測妊娠滋養細胞癌的發展，LIN等[34]運用NGS檢測絨毛膜癌細胞系(JEG-3和JAR)和正常胎盤細胞系(3A-subE)的微小RNA(miRNA)，檢測結果顯示JEG-3和JAR中miR-181b-5p和miR-181d-5p均有明顯改變，并且均表達BCL2蛋白，提示miR-181家族成員和BCL2蛋白可能是預測妊娠滋養細胞癌變風險的生物標志物。

3 小 結

隨著精準醫療的發展，女性惡性腫瘤的早期篩查成為臨床亟待解決的問題之一。相對于傳統的組織病理學檢測、血清學檢測、影像學檢查等手段，NGS有著較高的靈敏度和準確性。目前，NGS檢測的DNA標本可以來自子宮腔脫落細胞、宮頸管細胞涂片甚至是外周血等，以循環腫瘤DNA和甲基化的檢測為發展方向，NGS可實現BC、宮頸癌、卵巢癌、子宮內膜癌等女性惡性腫瘤的無創早篩。