黏蟲clip型絲氨酸蛋白酶基因的克隆及原核表達

連凱琪，紀 爽，2，周玲玲，時志琪，王 飛，2，張元臣，2

(1.安陽工學院 生物與食品工程學院，河南 安陽 455000；2.河南省太行山林業有害生物野外科學觀測研究站，河南 林州 456550)

黏蟲(Mythimnaseparate)是遠距離遷飛的典型害蟲，給我國及世界農業生產造成嚴重的經濟損失。目前蛋白酶主要分為絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和谷氨酸蛋白酶等，其中絲氨酸蛋白酶是黏蟲等鱗翅目昆蟲中腸蛋白酶的主要活性成員。絲氨酸蛋白酶家族是一類跨膜嵌合蛋白酶超家族，主要參與到降解蛋白質、防御細菌侵害、凝血過程、補體系統等生化反應中[1]。結構上，絲氨酸蛋白酶屬于β蛋白，其催化中心主要由3個氨基酸組成，其中Ser有重要的作用，被定位于C端結構域上，其他2個(Asp和His)在N端結構域上。另外，包括底物結合位點和底物特異性口袋等行使重要功能的位點均位于C端結構域，因此，絲氨酸蛋白酶的C端結構域是主要功能區，而保證催化中心三聯體的結構穩定性主要是N端結構域在發揮作用[2]。近些年，世界上眾多的學者已經從許多昆蟲體內克隆得到多種絲氨酸蛋白酶基因，并對其進行了生物學分析以及先天免疫、消化等生理功能的研究。其中，在盲蝽(Creontiadesdilutes)、甘藍夜蛾(Mamestrabrassica)、蓖麻夜蛾(Achaeajanata)、飛揚阿夜蛾(Achaeajanata)等昆蟲中都有絲氨酸蛋白酶研究的報道[3-4]，在美洲棉鈴蟲(Helicoverpazea)、球菜夜蛾(Agrotisipsilon)、家蠶(Bombyxmori)、野桑蠶(Bombyxmandarina)和煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)等昆蟲體內擴增到多條絲氨酸蛋白酶基因[5-6]。Lange等[7]利用Sf21昆蟲表達系統，獲取了有活性的大型溞(Daphniamagna)絲氨酸蛋白酶；周曉群等[8]利用原核表達系統表達了苜蓿夜蛾(Heliothisdipsacea)中腸中克隆的絲氨酸蛋白酶基因。目前，研究者主要對黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、家蠶、煙草天蛾(Manducasexta)等生物體內的絲氨酸蛋白酶的基因序列和生理功能開展了研究，而對于黏蟲絲氨酸蛋白酶的相關研究較少。Zhou等[9]曾克隆了2種黏蟲中腸絲氨酸蛋白酶基因，并研究了其在食物消化中的作用。

本研究克隆了一種新的黏蟲絲氨酸蛋白酶基因(MsPG)，首先采用RACE技術克隆黏蟲中腸絲氨酸蛋白酶的全長基因，然后通過大腸桿菌原核表達系統表達黏蟲絲氨酸蛋白酶，為進一步研究絲氨酸蛋白酶基因的功能奠定基礎，也為黏蟲新型殺蟲劑的研發提供新的靶點。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

所用昆蟲由黑光燈誘捕方法捕獲，用約8%蜂蜜水飼養于安陽工學院生物實驗室內，待其產卵，將卵置于25 ℃、濕度約75%、光照周期14L∶10D的培養箱中利用小麥葉片進行飼養，得到四齡幼蟲備用。

RNA反轉錄試劑盒、RNA酶抑制劑、DL2000 DNA Marker、2×PCR master mix、TaqDNA 聚合酶、質粒提取試劑盒、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ 限制性內切酶、Premixed Protein Marker(low)、T4-DNA連接酶、通用引物M13F/R和T7F/R購自寶生物工程(大連)有限公司；RACE試劑盒購自Clontech公司；DNA膠回收試劑盒購自OMEGA公司；pEASY-T3 Cloning Vector購自北京全式金生物技術有限公司；TRIzol購自Invitrogen公司；pET30a(+)Vector、E.coliDH5α和BL21感受態細胞由安陽工學院生物與食品工程學院實驗中心保存。

1.2 絲氨酸蛋白酶部分基因的擴增

在生理鹽水中解剖四齡黏蟲幼蟲獲取中腸，充分快速研磨后按照TRIzol提取RNA的方法提取總RNA。按照RNA反轉錄試劑盒的說明書，將RNA反轉錄成cDNA。根據NCBI GenBank上發表的鱗翅目昆蟲粉蚊夜蛾(Trichoplusiani，登錄號：XM_026875618.1)、斜紋夜蛾(Spodopteralitura，登錄號：XM_022965589.1)等昆蟲的絲氨酸蛋白酶序列信息，利用Primer 5.0軟件設計1對特異性引物Ser-PRF和Ser-PRR(表1)。以反轉錄的cDNA為模板，PCR擴增MsPG的部分基因。PCR擴增體系：cDNA模板 1 μL，Ser-PRF和Ser-PRR(20 μmol/L)各0.5 μL，2×PCR master mix 25 μL，加ddH2O補充至50 μL。反應條件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，40個循環；72 ℃ 10 min。將PCR反應產物進行1% 瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段，并構建到pEASY-T3克隆載體上，選擇陽性質粒送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

表1 試驗所用引物序列Tab.1 Primer sequences used in the study

1.3 絲氨酸蛋白酶兩端基因的擴增和基因全長序列拼接

根據1.2中克隆測序獲得的MsPG基因部分序列，設計擴增5′端和3′端的引物5GSP和5NGSP以及3GSP和3NGSP(表1)。以1.2中提取的總RNA為模板，按照參考文獻[10]中的方法，分別擴增MsPG基因的5′端和3′端，并構建到pEASY-T3載體上進行測序。將獲得的5′端和3′端基因序列以及1.2中獲得的MsPG部分基因序列進行拼接，得到MsPG的全長序列。

1.4 絲氨酸蛋白酶基因和編碼蛋白的分析

將MsPG的全長序列在NCBI-Blast上進行比對，進而利用NCBI中的ORF Finder對開放閱讀框(ORF)進行在線預測。根據基因序列推導其氨基酸序列，通過SignalP 4.1 Server對其信號肽進行預測，通過Protparam軟件在線預測其分子質量和等電點。然后，采用DNAMAN 7.0軟件對不同物種間絲氨酸蛋白酶氨基酸序列進行多重聯配分析，利用MEGA 5.0軟件中最大似然法構建系統進化樹。

1.5 重組質粒pET30a(+)-MsPG的構建

根據1.4中對ORF和信號肽的預測，將ORF基因去掉信號肽序列后進行引物設計(pr1F和pr1R)，同時引入限制性內切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ的酶切位點(表1)。以1.2中合成的cDNA為模板，按照1.2中的PCR擴增體系和方法進行基因擴增，將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶進行膠回收。使用EcoRⅠ和Hind Ⅲ分別對膠回收的目的片段和pET30a(+)載體進行雙酶切，將酶切產物進行膠回收，按照一定比例將酶切后的目的片段和pET30a(+)載體混勻，在T4-DNA連接酶的作用下16 ℃連接過夜。將連接產物轉化至E.coliDH5α感受態細胞中，涂布含卡那霉素的LB固體平板上，37 ℃恒溫箱培養15 h，挑取單克隆菌落搖菌12 h，提取質粒進行鑒定，將鑒定陽性的質粒送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.6 重組質粒pET30a(+)-MsPG的表達

將重組質粒和空載體質粒分別轉化E.coliBL21感受態細胞，涂布于含卡那霉素的LB固體平板上，37 ℃恒溫箱培養12 h。挑取單克隆菌落置于10 mL含卡那霉素的LB培養基中，搖菌14 h。取200 μL菌液接種于10 mL含卡那霉素的LB培養基中，制取5管。同時設置1管空載體表達菌液作為陰性對照。將6管菌液置于37 ℃搖床中，200 r/min搖菌約3 h(OD600≈0.6)。向5管重組質粒菌液中加入IPTG(終濃度0.1 mmol/L)，分別置于20，25，30，35，40 ℃搖床內，180 r/min誘導8 h。同時向pET30a(+)空質粒菌液加入相同濃度IPTG，置于20 ℃、180 r/min條件下誘導8 h，作為對照組。分別從6管菌液中取1.5 mL菌液到6個離心管中，13 000 r/min、25 ℃離心5 min，棄上清，收集菌體。用PBS重懸菌體，并加入蛋白質電泳上樣緩沖液，沸水煮10 min，然后12 000 r/min離心1 min，吸取10 μL上清液進行SDS-PAGE分析。

2 結果與分析

2.1 MsPG基因cDNA序列的擴增

通過反轉錄PCR獲得MsPG基因部分核苷酸序列，共977 bp，之后利用Clontech公司的RACE試劑盒和自行設計的特異性RACE引物，擴增得到863 bp的5′端序列和約490 bp的3′端序列(圖1)。將獲得的核苷酸序列進行拼接得到目的基因全序列共2 010 bp，并命名為MsPG。隨后通過ORF全長的擴增和測序進一步驗證了MsPG基因。

M.DL2000 DNA 標記；1.MsPG片段的PCR產物；2.5′ RACE產物；4.3′ RACE產物；3，5.5′ RACE 和 3′ RACE的陰性對照。M.DL2000 DNA Marker；1.PCR product of partial MsPG gene；2.PCR product of MsPG by 5′ RACE；4.PCR product of MsPG by 3′ RACE；3，5.The negative control of 5′ RACE and 3′ RACE.

2.2 MsPG基因和編碼蛋白的分析

利用DNAMAN 7.0對所得到的全長序列進行分析，結果如圖2所示，MsPG基因序列為2 010 bp，末端帶有典型的Poly(A)尾。NCBI ORF Finder預測的ORF為1 593 bp，編碼530個氨基酸，分子質量為67.6 ku，等電點7.63。SignaIP 4.1預測結果顯示，其N端有一段長21個氨基酸殘基的信號肽。參考已報道文獻[9]，發現MsPG活性中心為GDSGGP(圖2)。根據于潔等[11]的報道，發現MsPG具有含6個半胱氨酸的clip結構域(圖2)，推測其屬于clip型絲氨酸蛋白酶。

信號肽序列用淺藍色陰影表示；活性中心(GDSGGP)用紅色陰影表示；下劃線部分為clip結構域；6個半胱氨酸由方框標記。

2.3 MsPG編碼的氨基酸序列比對

將MsPG編碼的氨基酸序列在NCBI-Blast上進行搜索，顯示其與鱗翅目昆蟲的絲氨酸蛋白酶序列相似性為70.00%～91.92%，其中與煙芽夜蛾(登錄號：PGG78401.1)的一致性最高，為91.92%。使用DNAMAN對黏蟲和代表性昆蟲的絲氨酸蛋白酶氨基酸序列進行多重比對，發現它們都具有絲氨酸蛋白酶的活性中心GDSGGP(圖3)。

下劃線表示氨基酸序列為活性中心GDSGGP。深色背景表示一致性為100%，紅色背景表示一致性大于等于75%，淺藍色背景表示一致性大于等于50%。HvB5.煙芽夜蛾(登錄號：PCG78401.1)；HaPE.棉鈴蟲(登錄號：XP_021187378.1)；S1TS.斜紋夜蛾(登錄號：XP_022821357.1)；AtX1.臍橙螟(登錄號：XP_013191307.1)；BaPS.叢林斜眼蝶(登錄號：XP_023945684.1)；PxPZ.柑橘鳳蝶(登錄號：XP_013176912.1)；PpPE.玉帶鳳蝶(登錄號：XP_013135138.1)；DpPE.黑脈金斑蝶(登錄號：XP_032527749.1)；GmPE.大蠟螟(登錄號：XP_026758758.1)；AtX2.臍橙螟(登錄號：XP_013191309.1)；ApUN.燈蛾屬(登錄號：CAB3239924.1)；MsPE.煙草天蛾(登錄號：XP_030031627.1)。

利用MEGA 5.0軟件中的最大似然法構建了絲氨酸蛋白酶的系統進化樹，結果顯示，黏蟲MsPG與斜紋夜蛾、煙芽夜蛾和棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)的絲氨酸蛋白酶遺傳距離較近(圖4)。

圖4 黏蟲和其他物種絲氨酸蛋白酶氨基酸序列的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of serine protease among Mythimna separate and other species based on amino acid sequences

2.4 重組質粒pET30a(+)-MsPG的構建

通過PCR擴增MsPG基因去除信號肽序列的編碼區序列，同時引入酶切位點EcoRⅠ和Hind Ⅲ，核酸電泳結果表明，擴增到1 547 bp的序列(圖5)。

M.DL2000 DNA 標記；1，2.去除信號肽的MsPG ORF基因的PCR產物；3.重組質粒pET30a(+)-MsPG雙酶切產物。

利用T4-DNA連接酶將EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切過的MsPG基因片段和pET30a(+)進行連接，對構建的重組質粒pET30a(+)-MsPG進行雙酶切鑒定，核酸電泳結果表明，酶切產物出現2條帶，其中一條約為1 547 bp(圖5)，與預期大小相符，測序結果進一步證實重組質粒pET30a(+)-MsPG構建成功。

2.5 重組質粒pET30a(+)-MsPG的表達

將構建成功的重組質粒pET30a(+)-MsPG和空載體pET30a(+)轉化到E.coliBL21菌株中，在不同溫度下經IPTG誘導后，處理樣品進行SDS-PAGE，結果表明，pET30a(+)-MsPG誘導組在66.4 ku附近出現一條特異性條帶，與預期的67.6 ku相符，而對照組沒有出現相同的條帶，說明融合蛋白MsPG在大腸桿菌中成功表達，且在不同溫度下的表達量有差別，25 ℃為最優表達溫度(圖6)。

M.蛋白質分子質量標準；1—5.分別為pET30a(+)-MsPG在40，35，30，25，20 ℃下的誘導表達；6.pET30a(+)的誘導表達。M.Protein Marker；1—5.Induced expression of pET30a(+)-MsPG at40，35，30，25，20 ℃，respectively；6.Induced expression of pET30a(+).

3 結論與討論

在昆蟲的體液免疫中，絲氨酸蛋白酶參與到其抗菌過程，通過促進抗菌肽的合成，幫助昆蟲抵御外敵。有研究表明，家蠶BmSP142能夠有效地抑制病毒的增殖，幫助機體抵抗病毒的入侵[12]。在對煙草天蛾及黃粉蟲(Tenebriomolitor)的絲氨酸蛋白酶基因的進化分析中發現，這些基因均有多個分支，且在機體的信號級聯反應中起到類似的作用[13]。一些對鱗翅目昆蟲的研究表明，玉米螟(Ostrinianubilalis)敏感菌株可溶性部分的絲氨酸蛋白酶含量與耐藥菌株相比有顯著差別[14]。絲氨酸蛋白酶參與蘇云金芽孢桿菌(Bt)的原生酶激活和原生酶/毒素降解[15]。因此，對絲氨酸蛋白酶的研究有利于輔助Bt對害蟲進行防治，為研發新一代殺蟲劑奠定基礎。中腸是黏蟲消化吸收營養物質的主要場所，具有大量的微生物和蛋白質，絲氨酸蛋白酶是埃及伊蚊[16]、棉鈴蟲[17]和蓖麻夜蛾[18]中腸最重要的消化酶。Zhou等[9]對黏蟲胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶和胰凝乳蛋白酶型絲氨酸蛋白酶基因的研究發現，前者與黏蟲的消化和蛻皮密切相關，后者與有毒物質的消化降解密切相關。然而，目前對黏蟲clip型絲氨酸蛋白酶基因的研究還未見報道。

本研究利用RT-PCR和RACE技術成功克隆黏蟲的絲氨酸蛋白酶全基因序列，共2 010 bp，命名為MsPG，生物信息學分析發現，其開放閱讀框為1 593 bp，編碼530個氨基酸殘基，這些特征與親緣關系較近的其他絲氨酸蛋白酶相似。將MsPG氨基酸序列在NCBI-Blast上比對，發現其與其他昆蟲氨基酸序列相似性達到70.00%～91.92%，其中與煙芽夜蛾(登錄號：PGG78401.1)的一致性最高(91.92%)。對氨基酸序列分析發現，在N端有信號肽序列，具有多個半胱氨酸殘基可以組成多個二硫鍵，還有保守的GDSGGP序列，可以參與降解底物的過程。氨基酸序列同源性分析發現，黏蟲MsPG與其他鱗翅目昆蟲絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列一致性較高，推測它們行使的功能相似。絲氨酸蛋白酶具有保守性，它們都有類似的一級結構，主要包括clip結構、sushi結構、wonton結構、frizzle結構等[19]，其中clip結構常具有35～60個氨基酸殘基，并有6個半胱氨酸組成的3個二硫鍵[1]，BmSP95就是clip型絲氨酸蛋白酶，其C端有1個類似于胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶結構域(tryp_spc)，另外，還有1個富含脯氨酸的保守序列位于C端和N端之間[20]。本試驗中黏蟲MsPG的N端也含有clip結構域，推測其可能屬于clip型絲氨酸蛋白酶。

本研究進一步構建了原核表達載體pET30a(+)-MsPG，并將其導入E.coliBL21感受態細胞中，利用IPTG在5個不同溫度下對目的蛋白進行誘導，發現其最優表達溫度為25 ℃。黏蟲MsPG全長基因尚屬首次克隆并公布，對于MsPG的功能仍不清楚，后續將進行融合蛋白純化，深入研究MsPG的功能。

綜上，本研究首次克隆并公布一種黏蟲絲氨酸蛋白酶基因，其具有絲氨酸蛋白酶家族保守的功能位點，且在大腸桿菌原核表達系統中0.1 mmol/L IPTG誘導下的最佳表達溫度是25 ℃。