山羊CIDE家族基因克隆分析及互作蛋白預測鑒定

李 琪，楊昌恒，王 永，林亞秋，，向 華，朱江江，

(1.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，西南民族大學，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，西南民族大學，四川 成都 610041)

動物的生長、發育及繁殖過程皆會受到脂代謝的影響。簡州大耳羊是我國培育的第2個肉用山羊品種，作為我國重要的山羊品種資源，有關其脂質代謝的相關基因的克隆、功能分析、生物學特性方面的研究可以為改良其遺傳特性提供理論依據。最初發現CIDE蛋白家族具有前凋亡蛋白的功能，后逐漸被發現是一類脂滴相關蛋白，在機體脂質平衡中也起到了重要的作用，且該家族基因還是人類肥胖的候選基因之一。探索CIDE家族基因調控網絡及其在山羊脂代謝過程中的作用具有重要意義。CIDE(Cell death-inducing DFF45-like effectors)家族剛開始被發現時，被認為與細胞凋亡相關，并且因為與DFF45(DNA fragmentation factor，DFF45)的 N 端結構域高度同源而得名[1-3]。隨著人們不斷地研究發現，CIDE 家族蛋白主要參與調控細胞的脂代謝，是一類和脂類代謝密切相關的蛋白。CIDE家族共有3個成員，在小鼠中為 CIDEA、CIDEB、FSP27(Fat-specific protein 27)[4]，在人體中為 CIDEA、CIDEB、CIDEC[5]。CIDE 家族蛋白的氨基酸序列十分保守，其 N 端(CIDE-N)為一段保守的堿性序列，后面緊跟著一段酸性序列，CIDE蛋白的N 端序列之間可以形成相互作用，也可以通過該結構與其他蛋白形成相互作用。CIDE 蛋白的 C 端可以介導脂滴的融合，且其疏水區具有脂滴定位功能[6-9]。脂肪組織是機體儲存能量的主要部位，包括白色和棕色脂肪組織。白色脂肪組織細胞的大部分空間被一個大脂滴所占據，棕色脂肪組織細胞中的脂滴比較小，但通常數量較多[10]。脂滴(Lipid droplet，LD)是細胞內存儲脂質的主要亞細胞器，其核心由中性脂質構成，外圍為單層磷脂膜，對體內的脂質平衡起重要的調控作用[11-13]。脂滴的膜上分布有多種蛋白質，能夠合成或分解脂滴中的磷脂及中性脂，從而調節脂滴的大小及功能[14]。CIDE家族的蛋白均定位于脂滴表面，能夠在脂滴與脂滴之間的接觸位點上形成脂滴融合復合物(Lipid droplet fusion complex，LDFC)，連通2個脂滴，促進脂滴間的融合[10]，從而調控脂滴的大小。當過表達CIDE家族基因時，可使細胞內脂滴增大，而在細胞或組織中敲除或是沉默CIDE家族基因時，會導致脂滴變小[15-16]。然而，目前有關脂滴形成的精確機制以及CIDE家族在其中的調控網絡還尚不清楚。本研究以簡州大耳羊為研究對象，通過基因克隆及生物信息學分析，分析了CIDE家族基因的生物學特性，為其功能研究奠定了基礎。并通過實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測了CIDE家族基因在山羊不同組織中的表達水平，發現了與CIDE家族基因表達量具有相關性的基因，可為進一步研究精確的脂滴形成機制以及進一步揭示CIDE基因在脂代謝中的調控網絡提供參考和理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 隨機選取成年(1周歲)健康的簡州大耳羊10只為試驗動物(購自四川省簡陽市大哥大牧業有限公司)。屠宰后采集其心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、背最長肌、股二頭肌等組織樣品，將采集的各組織分割成黃豆大小，用DEPC水清洗干凈后迅速裝入無RNase的凍存管中，置于液氮中保存，用于后續組織RNA的提取。

1.1.2 試驗試劑 DNA回收試劑盒、DNA聚合酶、大腸桿菌DH5α感受態細胞購自天根生化科技有限，TRIzol、SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)試劑盒、pMD-19T Vector購自TaKaRa公司，反轉錄試劑盒購自Thermo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 組織總RNA提取及反轉錄 用 TRIzol 法提取簡州大耳羊的心、肝、脾、肺、腎、瘤胃等組織的總RNA，測定總RNA的OD260/280值，當該值在 1.8～2.0說明可正常使用，然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。利用反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄合成 cDNA，反應體系及條件：總 RNA 1 μg，Oligo(dT)Primer 1 μL，加 DEPC 水至 12 μL，65 ℃ 5 min；然后加入 dNTP mix 2 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，RiboLock RNase Inhibitor 1 μL，Revert Aid RT 1 μL，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。-20 ℃保存，用于后期基因克隆及qPCR。

1.2.2 山羊CIDEB、CIDEC基因克隆 根據GenBank上山羊的CIDEB(XM_005685207.3)、CIDEC(XM_018038446.1)基因預測序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物(表1)。RT-PCR反應總體系：2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板cDNA 1 μL，加水補至25 μL。PCR擴增程序：預變性(98 ℃，3 min)；變性(98 ℃，30 s)，退火(CIDEB56 ℃/CIDEC59 ℃，30 s)，延伸(72 ℃，1 min)，共35個循環；延伸(72 ℃，10 min)，最后12 ℃保存。1%的瓊脂糖凝膠檢測后利用膠回收試劑盒對目的片段進行回收和純化，將純化后的產物連接到pMD-19T載體上，并通過熱激轉化到感受態細胞(DH5α)中，然后接種于涂有IPTG和X-gal的LB固體培養基(含Amp)上，37 ℃過夜培養后挑取白色陽性菌落，進行菌液PCR鑒定后送至成都擎科生物技術有限公司進行測序。

表1 克隆引物Tab.1 Primers for cloning

1.2.3 山羊CIDEs基因生物學特性分析 使用ProtParam在線工具對CIDE家族蛋白序列進行分析，使用Prot Scale(http：//web.expasy.org/protscale)預測CIDE蛋白的親疏水性，利用ExPASy(https：//embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)預測CIDE家族蛋白的跨膜區域。利用EMBL-EBI(https://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobius/)及TargetP-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-2.0/)進行CIDE家族蛋白信號肽的預測。使用SOPMA分析該家族蛋白的二級結構，通過SWISS-MODEL預測蛋白三級結構，利用STRING分析與其相互作用的蛋白。

1.2.4 山羊CIDE基因組織表達差異分析 根據NCBI上的序列設計CIDEA(KP120985)基因的RT-qPCR引物，根據克隆獲得的CIDEB、CIDEC基因序列設計其RT-qPCR引物(表2)。

利用RT-qPCR技術檢測CIDEs在各個組織中的表達差異，以UXT為內參基因矯正目的基因的相對表達水平，每個組織樣本設置3個重復。RT-qPCR結果采用 2-ΔΔCt法進行分析。

1.2.5 CIDE與其互作蛋白相對表達量相關性分析 利用STRING分析得到與CIDE家族基因相互作用的蛋白質，分別設計各互作蛋白的定量引物(表2)。RT-qPCR檢測以山羊心臟組織的Ct值為對照，結果用2-ΔΔCt法進行統計分析，檢測得到CIDEs基因在山羊中表達量最高的組織，并檢測該組織中與其相互作用的基因的表達量，用SPSS軟件分析CIDE基因的表達量與其相互作用的基因的表達量的相關性，P<0.05時為差異顯著，P<0.01時為差異極顯著。

表2 定量引物Tab.2 Primers for quantitative real-time PCR(qPCR)

表2(續)

2 結果與分析

2.1 山羊CIDEB、CIDEC基因克隆

本試驗以山羊的肝臟組織cDNA為模板，RT-PCR擴增獲得山羊CIDEB基因序列923 bp(圖1)，其中5′UTR為 146 bp，CDS區660 bp，3′UTR為117 bp，編碼219個氨基酸。CIDEC基因1 043 bp(圖1)，其中5′UTR 為23 bp，CDS區714 bp，3′UTR 為306 bp，編碼237個氨基酸。

A.克隆所得山羊CIDEB 923 bp；B.克隆所得山羊CIDEC 1 043 bp。A.Cloned goat CIDEB 923 bp；B.Cloned goat CIDEC 1 043 bp.

2.2 山羊CIDE基因生物學特性分析

2.2.1 蛋白理化性質分析 對山羊CIDEB蛋白序列進行分析，預測其蛋白分子式為C1090H1759N311O322S8，分子質量為24.629 33 ku；理論等電點(Theoretical pI)為9.30，不穩定指數為64.96，親水性總平均值為-0.372，推測該蛋白為堿性親水性不穩定蛋白。山羊CIDEC蛋白分子式為C1190H1905N321O350S11，分子質量為26.661 82 ku；理論等電點為9.27，不穩定指數為40.44，親水性總平均值為-0.258，推測該蛋白為堿性親水性不穩定蛋白(圖2)。CIDE家族蛋白信號肽預測結果如圖2及表3。

表3 CIDE蛋白信號肽預測Tab.3 Signal peptide of CIDE protein

圖2 CIDE蛋白的親疏水性、跨膜結構以及信號肽的預測Fig.2 Hydrophobic，transmembrane structure and signal peptide of CIDE protein

2.2.2 蛋白質結構及亞細胞定位預測 山羊CIDE家族蛋白均具有 2 個絲氨酸(Serine)磷酸化位點、1 個蘇氨酸(Threonine)磷酸化位點和 3 個酪氨酸(Tyrosine)磷酸化位點。

CIDEA二級結構預測顯示，79(39.11%)個氨基酸殘基可能形成 α-螺旋(h)，34(16.83%)個氨基酸殘基可能形成β-折疊(e)，76(37.62%)個氨基酸殘基可能形成無規則卷曲(c)，13(16.83%)個氨基酸殘基可能形成β-轉角(t)(圖3-A)。CIDEB二級結構預測顯示，102(46.58%)個氨基酸殘基可能形成 α-螺旋(h)，34(15.53%)個氨基酸殘基可能形成β-折疊(e)，71(32.42%)個氨基酸殘基可能形成無規則卷曲(c)，12(5.48%)個氨基酸殘基可能形成β-轉角(t)(圖3-B)。CIDEC二級結構預測顯示，102(46.58%)個氨基酸殘基可能形成 α-螺旋(h)，34(15.53%)個氨基酸殘基可能形成β-折疊(e)，71(32.42%)個氨基酸殘基可能形成無規則卷曲(c)，12(5.48%)個氨基酸殘基可能形成β-轉角(圖3-C)。三級結構預測顯示，山羊和綿羊的CIDE家族蛋白的三級結構相似，與牛的CIDE家族蛋白三級結構略有不同。山羊CIDEB和CIDEC的三級結構相似，但其CIDEA的三級結構與CIDEB和CIDEC差別較大，而牛的CIDEC的三級結構與CIDEA和CIDEC差別較大，猜測可能與其功能的差別有關，但CIDEB蛋白的三級結構在不同物種中都很保守(圖4)。采用STRING 交互式數據庫搜索可能與CIDE家族蛋白各成員相互作用的蛋白，結果如圖5。

藍色線條.α-螺旋；紅色線條.β-折疊；紫色線條.無規則卷曲；綠色線條.β-轉角。Blue line.α-helix；Red line.β-sheet；Purple line.Random curl；Green line.β-turn.

A2、B2、C2分別為牛的CIDEA、CIDEB、CIDEC三級結構預測；A3、B3、C3分別為綿羊的CIDEA、CIDEB、CIDEC三級結構。A2(CIDEA)，B2(CIDEB)and C2(CIDEC)are predicted tertiary structure of the cattle；and A3(CIDEA)，B3(CIDEB)and C3(CIDEC)are predicted tertiary structure of the sheep.

圖5 山羊CIDEA(A)、CIDEB(B)和CIDEC(C)蛋白相互作用蛋白預測Fig.5 Prediction of proteins interacting with goat CIDEA(A)，CIDEB(B)and CIDEC(C)protein

2.2.3 氨基酸序列同源性比對及系統進化樹構建 利用NCBI對不同物種CIDEA的氨基酸同源性進行比較，發現簡州大耳羊與綿羊、牛、豬的同源性分別為99.01%，96.04%，83.17%。CIDEB與綿羊、牛、豬、人的同源性分別為100%，96.80%，87.67%，83.56%。CIDEC與綿羊、牛、人的同源性分別為99.16%，93.25%，84.87%。利用MEGA 5.0分別構建山羊CIDEA、CIDEB和CIDEC氨基酸序列系統進化樹，結果如圖6所示，山羊CIDEA、CIDEB、CIDEC均與綿羊親緣關系最近。

圖6 山羊 CIDEA(A)、CIDEB(B)、CIDEC(C)氨基酸序列系統進化樹Fig.6 Phylogenetic trees of goat CIDEA(A)，CIDEB(B)and CIDEC(C)amino acid sequence

2.3 山羊CIDE基因組織表達差異分析

以山羊心臟組織為對照，UXT為內參，分析qPCR定量結果可知CIDE家族基因在山羊各組織中均有表達，其中CIDEA在山羊瘤胃中高表達(圖7-A)；CIDEB在肝臟中高表達(圖7-B)；CIDEC在小腸中有較高水平的表達(圖7-C)。

差異顯著(P<0.05)用不同小寫字母表示；差異不顯著(P>0.05)用相同小寫字母表示。The significant difference(P<0.05)was indicated in different lowercase letters；and the insignificant difference(P > 0.05)was indicated in the same lowercase letters.

2.4 山羊CIDE與其互作蛋白表達量相關性分析

本研究利用RT-qPCR檢測了CIDEs在山羊不同組織中的表達量，發現CIDEA、CIDEB、CIDEC分別在山羊瘤胃、肝臟、小腸中表達量最高，進而檢測了在這些組織中與其相互作用的基因的表達量，通過SPSS軟件來分析CIDE基因的表達量與其相互作用的基因的表達量的相關性。由數據分析可以看出，CIDEA與DFFB(R=0.723，P=0.009)和ELOVL3(R=0.724，P=0.009)在瘤胃中的表達量具有極顯著正相關性(P<0.01)，與DIO2(R=0.560，P=0.046)、TMEM26(R=0.660，P=0.019)、PRDM16(R=0.694，P=0.013)、PLIN1(R=0.640，P=0.023)具有顯著正相關性(P<0.05)(表4)。CIDEB與DFFA(R=0.694，P=0.013)和SDR39U1(R=0.655，P=0.020)在肝臟中的表達量具有顯著正相關性(P<0.05)(表5)。CIDEC與PLIN2(R=0.596，P=0.034)、GPLD1(R=0.554，P=0.048)、ADIPOQ(R=0.578，P=0.040)在小腸中的表達量具有顯著正相關性(P<0.05)(表6)。

表4 CIDEA與其互作蛋白相關性分析Tab.4 Correlation analysis of CIDEA and its interacting proteins

表5 CIDEB與其互作蛋白相關性分析Tab.5 Correlation analysis of CIDEB and its interacting proteins

表6 CIDEC與其互作蛋白相關性分析Tab.6 Correlation analysis of CIDEC and its interacting proteins

3 結論與討論

影響機體脂代謝平衡的最主要細胞器是脂滴。Richard在1890年發現了脂滴的存在，但直到1991年，脂滴表面蛋白Plin1被發現后，才真正開始了有關脂滴的研究[17]。脂滴的外部是一層磷脂膜，內部為中性脂，但不同類型的細胞，其脂滴內部所含有的中性脂也會有所不同[18]，脂滴表面分布有許多功能蛋白。隨著越來越多的研究發現，脂滴的功能不僅僅局限于貯存脂質，還能夠參與脂質運輸、細胞之間、細胞內以及細胞膜與細胞器之間的信號傳遞過程等[19]。脂滴發生的異常[13]及CIDEs表達的異常[20]都會引發脂肪肝[21]、肥胖[22]等脂代謝疾病。而CIDEs在脂滴的形成及調控中起到了重要作用，該家族蛋白能在脂滴之間形成脂滴融合復合物(LDFC)，將中性脂從供體脂滴轉運到受體脂滴中，介導脂滴的融合[23-24]，促進大脂滴的形成。且其對脂滴的調控能力也不同，有研究發現CIDEA 和 CIDEC 融合脂滴的能力相同，CIDEB的能力較弱[25-26]，可能不同成員通過不同的調控通路來調節脂滴大小。

利用該試驗獲得CIDEB和CIDEC基因序列，可以為后續研究CIDEs調控山羊脂質代謝及在脂滴形成中的作用奠定基礎。并通過相關性分析，檢測到了不少與CIDEs表達量相關的基因，且大多與脂代謝或脂滴相關。如CIDEA與ELOVL3(R=0.724，P=0.009)的表達量具有極顯著正相關性，而ELOVL3 為極長鏈脂肪酸延長酶3，屬于脂肪酸延長酶(ELOVLs)家族，可以催化 C16、C18、C20 等極長鏈脂肪酸的伸長[27-28]。且在分化的牛肌肉衛星細胞(MDSCs)中 ELOVL3 與脂滴的亞細胞定位具有一致性，ELOVL3 可能通過催化脂肪酸的延伸來調節 TAG 的形成，從而促進脂滴的積累[29]。PLIN1 是分布于脂滴表面含量最多的脂滴包被蛋白，該基因的表達量也與CIDEA呈顯著正相關性(P<0.05)，該基因的過表達可在mRNA和蛋白水平促進脂肪代謝相關基因的表達，促使脂肪細胞中的脂滴數量、體積和甘油三酯含量增加[30]。CIDEC與PLIN2(R=0.596，P=0.034)的表達量具有顯著正相關性，PLIN2是脂滴包被蛋白2，是胞內脂滴表面相關蛋白之一，對脂滴的合成和降解具有重要作用[31]，且其可以上調SREBP2的表達，促進巨噬細胞內脂質積累[32]。由此可以推測，CIDE家族不同成員可以通過調控不同的基因或者受到不同基因的調控來調節生物體脂質代謝和脂滴的形成，通過檢測與其表達量相關的蛋白可以從側面驗證與其存在相互作用的脂代謝相關蛋白，并可能由此發現其調控通路。

RT-qPCR數據檢測未發現CIDE家族蛋白與其他蛋白表達量的相關性，且利用軟件也只分析到了部分與其相互作用的蛋白質，但越來越多的蛋白、轉錄因子被發現能夠調節CIDE家族蛋白，從而調控脂滴的發生和大小，影響機體的脂質代謝。CIDEA的表達會受到轉錄水平的調節，該基因的啟動子含有PPARα和 PPARγ 的應答元件，可被PPARs 的激動劑激活[33]。CIDEA可以調控棕色脂肪組織中的UCP1(解偶聯蛋白)，從而影響機體的脂代謝[34]。CIDEA還可與AMPK 的β亞基發生相互作用。CIDEA敲除小鼠的AMPK 蛋白表達水平及酶活性都有所升高，能夠促進脂肪酸的β氧化[35]。CIDEB能夠促進TAG 從脂滴向極低密度脂蛋白(VLDL)轉運，該蛋白C端的結構可以和位于VLDL 上的 ApoB-100相互作用，提高了VLDL的脂肪組裝、成熟及分泌過程[36]。PGC1β 能夠促進CIDEB轉錄水平的調節作用，進而調控 VLDL 的分泌[37]，影響脂滴的大小。對脂肪細胞中內源性的 Plin 和 Fsp27進行免疫共沉淀，發現Plin 中心結構域中的氨基酸 291—321部分介導了 Plin 與 Fsp27 的相互作用[38]，Plin1 可以與 CIDEC相互作用促進脂滴的融合[39]。由此可見，無論是軟件分析還是RT-qPCR檢測結果，只能發現部分與CIDE家族蛋白相互作用的蛋白，探索CIDE家族完整的調控網絡還需要更進一步的研究。

越來越多的蛋白被發現能夠與CIDE家族蛋白發生相互作用，參與脂滴的發生，通過研究與其相互作用的蛋白質、轉錄因子等，可進一步了解CIDE家族調控網絡及其在脂質沉積、脂質代謝中的作用，也有助于更進一步地掌握脂滴形成的精確機制。且通過研究影響脂滴生長的相關基因，可以為肥胖、脂肪肝等脂代謝相關疾病的治療提供了理論信息。

本研究成功克隆獲得山羊CIDEB基因CDS序列660 bp，編碼219個氨基酸，CIDEC基因CDS區714 bp，編碼237個氨基酸。CIDEA、CIDEB、CIDEC基因分別在山羊瘤胃、肝臟、小腸中表達量最高。CIDEA與DFFB和ELOVL3在瘤胃中的表達量具有極顯著正相關性，與DIO2、TMEM26、PRDM16、PLIN1具有顯著正相關性。CIDEB與DFFA和SDR39U1在肝臟中的表達量具有顯著正相關性。CIDEC與PLIN2、GPLD1、ADIPOQ在小腸中的表達量具有顯著正相關性。該結果為進一步闡明CIDEs在脂質代謝及脂滴形成中的作用以及CIDE家族調控網絡提供理論基礎。