低蛋白日糧對湘東黑山羊肉品質及肌源性調節因子基因表達的影響

陳文勛，周 婷，顏瓊嫻，田麗娜，曹滿湖，譚支良，鄒愛華

(1.中國科學院 亞熱帶農業生態研究所，亞熱帶農業生態過程重點實驗室，動物營養生理與代謝過程湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410125；2.中國科學院大學，北京 100049；3.湖南農業大學 動物科技學院，湖南 長沙 410128；4.桃源縣農業綜合行政執法局，湖南 常德 415700)

畜禽養殖排泄物中過量的氮排放會對環境造成不利影響，合理降低畜禽日糧蛋白水平可提高氮(N)的利用率，減少N的排放，同時能夠節約飼料成本且不影響畜禽正常的生長發育[1]。一般來說，隨著日糧N攝入量增加，動物的N排泄量也相應增加，反芻家畜日糧中瘤胃降解蛋白與瘤胃非降解蛋白比例增加也會導致尿N排泄量增多[2-3]。相關研究表明，降低肉牛日糧蛋白水平，同時補充過瘤胃賴氨酸和蛋氨酸可提高其生長性能和氮利用率[4-5]；降低奶牛日糧蛋白水平，補充過瘤胃賴氨酸、蛋氨酸和組氨酸可緩解低蛋白對產奶性能的影響[6]。因此，降低日糧蛋白水平的同時，保持日糧中必需氨基酸的配比平衡，才能提高反芻動物的蛋白質利用率，達到降低氮排放的目的。

日糧中蛋白質水平和能量水平可影響胴體的脂肪沉積和肌肉生長。王東等[7]研究報道，降低育肥豬日糧蛋白水平可改善肉色并提高肌肉粗脂肪含量，進而調節豬肉品質。葛長榮等[8]報道低蛋白水平日糧飼喂烏金豬可獲得較好的肉品質，主要表現為肌內脂肪、肌苷酸和肌肉風味物質的增加。藏羊和小尾寒羊飼喂低蛋白日糧，對其背最長肌脂肪含量和肌肉氨基酸含量均有顯著影響[9]。

骨骼肌發育依賴于肌源性祖細胞的分化，肌源性祖細胞受肌源性調節因子(MRF)家族的表達調控。一般將 MRFs分為2個功能組：初級 MRFs，包括MYF5和MYOD，它們是骨骼肌成肌細胞形成所必需的；MYF6和MYOG屬于次級 MRFs，較晚表達，在肌細胞的分化過程中發揮重要作用。有研究發現，肌肉中MYOG和MYF5二者具有強正相關性(r=0.869)，MYF5和MYF6有反向共表達效應，MYOG和MYOD也有長期的正向共表達效應[10-11]。骨骼肌肌球蛋白可調控輕鏈編碼基因MYL，作為調控骨骼肌發育和影響骨骼肌肉質的候選基因，研究發現，MYL在中國天府山羊的后背最長肌中表達的水平相對較高，但表達量隨日齡增長逐漸降低[12]。MRF家族控制肌肉細胞的生長分化，肌纖維的數量和大小也與之相關，因此，MRF家族的表達也對肉質和風味有潛在調節作用[13]。

湘東黑山羊作為湖南省一種具有地方特色、肉質佳的山羊品種，關于低蛋白質水平對其肉品質和MRF家族基因表達的影響研究較少。因此，本試驗通過飼喂2種不同蛋白水平日糧，來探索低蛋白日糧對湘東黑山羊肉品質的影響，并通過比較不同部位肌肉的氨基酸和脂肪酸組成和MRF家族基因表達，初步探索蛋白質水平對湘東黑山羊肉品質影響的機制，研究結果可為反芻家畜蛋白質營養研究和節能減排等生產實踐提供理論參考和生產依據。

1 材料和方法

1.1 試驗設計

本試驗選取8月齡左右體質量在(19.6±3.55)kg 的生長期的湘東黑山羊母羊24頭，隨機分為2組，即正常蛋白組(CON，CP：10.77%)與低蛋白組(LP，CP：5.52%)，每組12頭羊，單籠飼養，自由飲水，每天定時(分別在8：30和17：30)飼喂，同時記錄每只羊的采食量。試驗開始前所有羊統一驅蟲(左旋咪唑，8 mg/kg)，試驗喂飼周期共70 d，其中預試期為25 d，正試期為45 d，日糧配方見表1。

表1 試驗日糧及營養成分(干物質基礎)Tab.1 Composition and nutrient level of the experimental diets(DM basis)

1.2 樣品采集

試驗正試期結束后所有試驗羊全部屠宰，采集右側胴體背最長肌、股外側肌和半腱肌，剝離肉眼可見的局部脂肪、筋膜后于-20，-80 ℃分別保存一份樣本備用，另取一份肌肉樣用4%多聚甲醛固定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 胴體特征測定和肉品質評定 屠宰后剝離毛皮，去除頭、蹄、尾部和內臟器官后，稱量胴體，熱胴體產量計算如下：

熱胴體產量=熱胴體質量(kg)/宰殺前空腹體質量(kg)×100%

①

屠宰率=熱胴體質量(kg)/宰殺前的體質量(kg)×100%

②

在胴體左側第 12 肋骨和第 13 肋骨之間測量背肌(Longissi musthoracis，LT)的寬度和厚度，并且通過以下等式計算眼肌面積：

眼肌面積(cm2)=寬度(cm)×厚度(cm)×0.7

③

收集第 10～12 肋骨的背肌用于 pH 和肉色測定；使用pH計(205，TestoSE&Co，Freiburg，德國)測量 pH45min(宰殺后 45 min的 pH 值)和 pH24h(宰殺后24 h的pH值)，在肌肉的3個不同的位置上進行測量后取平均值；根據色差計法，宰后45 min和24 h使用色差計(CR-400，Konica Minolta Group，Tokyo，日本)測量肌肉樣品的 L*(亮度)、a*(紅度)和 b*(黃度)值，色度計用標準白板(8 mm 直徑孔徑，d/0 照明系統)校準，在肌肉的3個不同位置上測量后取平均值；測量失水率，將第8～10肋骨中的約5 g的 LT 肌肉置于10層濾紙之間，以35 kg的負荷按壓5 min。

失水率=(壓前質量-壓后質量)(g)/壓前質量(g)×100%

④

1.3.2 肌肉氨基酸與脂肪酸測定 稱取 0.2 g冷凍干燥后的肌肉樣品，加入干凈的安瓿瓶中，再加入6 mol/L的鹽酸10 mL，使用酒精噴燈將安瓿瓶密封，110 ℃烘箱水解4 h。雙蒸水多次沖洗，定容至100 mL的容量瓶中。取1 mL的定容液使用金屬浴70 ℃蒸干，置入1 mL 0.01 mol/L的鹽酸溶解管中沉淀，樣品過0.22 μmol/L濾膜，上機測定(氨基酸分析儀l-8800，Hitachi，Tokyo，日本)。

稱取 0.5 g 冷凍干燥后的肌肉樣品，依次添加4 mL二氧化苯-甲基石油醚作為混合溶劑(二氧化苯與甲基石油醚按一定的體積比 1∶1混合)，密閉浸提4 h后，加入4 mL氫氧化鉀-無水甲醇溶液(0.4 mol/L)，振蕩 3 min后靜置30 min。加入超純水分層，取上層甲醇溶液，加入一定量的氫氧化鉀無水硫酸鈉，吸去殘留的水分。取上清液400 μL，加入600 μL正己烷稀釋，0.45 μmol/L濾膜過濾后使用液體進樣氣相色譜儀測定(安捷倫 7890a，美國)。

1.3.3 肌纖維類型分析 肌纖維類型鑒定使用ATP酶化學染色法，具體方法參考侯普馨[14]的研究。制片完成后樹膠封片，顯微鏡(Leica DM)下100倍鏡檢拍照，每張切片選取5個視野，每個視野下選取200根肌纖維，使用Image J軟件分析肌纖維類型以及橫截面積。

1.3.4 肌源性調節因子基因表達 使用TRIzol試劑提取背肌、股外側肌和半腱肌總RNA，紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度和純度，使用TaKaRa反轉錄試劑盒(RR047A)將總RNA反轉錄為cDNA。引物序列見表2。實時熒光定量PCR使用TaKaRa試劑盒(RR820A)，LightCycler480系統，具體試驗程序參考楊宏等[15]的研究。以ACTB作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算CON和LP組肌肉生長因子基因相對表達量。

表2 熒光定量 PCR 的引物序列信息Tab.2 Primer sequence information of fluorescence quantitative PCR

1.4 數據處理與統計分析

所有數據采用Excel 2016進行初步整理，在SPSS 25軟件中對胴體品質、肌纖維類型、肌肉氨基酸和脂肪酸、基因表達數據利用獨立樣本t檢驗進行顯著性分析，血液游離氨基酸數據進行重復度量分析(時間與處理之間無交互作用)。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，0.05

2 結果與分析

2.1 低蛋白日糧對湘東黑山羊生長性能和胴體品質的影響

如表3所示，低蛋白日糧對湘東黑山羊終末體質量、平均日增質量均沒有明顯的差異(P>0.05)，但低蛋白日糧組平均日增質量指標出現了負值，且飼料轉化率呈現降低的趨勢(P<0.1)，說明低蛋白日糧嚴重影響湘東黑山羊的飼料轉化效率和生長性能。低蛋白組與對照組在胴體質量、屠宰率、眼肌面積和失水率指標上均無顯著差異(P>0.05)。肌肉pH值在屠宰后45 min 和24 h 這2個時間點均無顯著差異(P>0.05)，肉色a*值與b*值在2個時間點也無顯著差異(P>0.05)，但低白蛋白組顯著提高了屠宰后24 h 肉色L*值(P<0.05)。

表3 低蛋白日糧對湘東黑山羊胴體品質的影響Tab.3 Effect of low protein diet on the performance and carcass quality of Xiangdong black goats

2.2 低蛋白日糧對骨骼肌肌纖維類型及大小的影響

根據肌纖維染色后顏色的深淺不同，可將其區分為：Ⅰ型(Type Ⅰ，黑色)和Ⅱ型(Type Ⅱ，褐色)2種類型(圖1)。如圖2所示，Ⅰ型肌纖維和Ⅱ型肌纖維的比例在2組之間均無顯著差異(P>0.05)，且低蛋白日糧對Ⅰ型肌纖維橫截面積、Ⅱ型肌纖維橫截面積均無顯著影響(P>0.05)，僅在半腱肌中肌纖維總平均橫截面積呈現降低的趨勢(0.05

背最長肌(A.對照組；D.低蛋白組)；半腱肌(B.對照組；E.低蛋白組)；股外側肌(C.對照組；F.低蛋白組)。Longissimus dorsi(A.CON；D.LP)；Semitendinosus(B.CON；E.LP)；Vastus lateralis (C.CON；F.LP).

2.3 低蛋白日糧對肌肉氨基酸組成的影響

如表4所示，低蛋白日糧處理對背最長肌肌肉中的必需氨基酸和非必需氨基酸含量無顯著影響(P>0.05)；半腱肌中，低蛋白日糧處理僅顯著降低谷氨酸含量(P<0.05)，蘇氨酸和絲氨酸的含量呈現下降趨勢(0.05

表4 低蛋白日糧對背最長肌、半腱肌和股外側肌氨基酸組成的影響Tab.4 Effect of low protein diet on amino acid composition of longissimus dorsi，semitendinosus and vastus lateralis g/100g

2.4 低蛋白日糧對肌肉脂肪酸組成的影響

如表5所示，低蛋白日糧僅降低背最長肌中油酸的含量(P<0.05)，而肉豆蔻酸含量呈現升高趨勢(0.050.05)；半腱肌中，低蛋白組二十碳二烯酸和二十二烯酸含量顯著降低(P<0.05)，總飽和脂肪酸、總單不飽和脂肪酸和總多不飽和脂肪酸含量均無顯著差異(P>0.05)；股外側肌中，低蛋白組總多不飽和脂肪酸含量顯著降低(P<0.05)，其中花生四烯酸和油酸含量顯著降低(P<0.05)，肉豆蔻酸和亞油酸呈現降低趨勢(0.05

表5 低蛋白日糧對背最長肌、半腱肌和股外側肌脂肪酸組成的影響Tab.5 Effect of low protein diet on fatty acid composition of longissimus dorsi，semitendinosus and vastus lateralis g/100g

A、D.背最長??；B、E.半腱?。籆、F.股外側肌；柱狀圖未標記字母的為差異不顯著(P>0.05)。A，D.Longissimus dorsi；B，E.Semitendinosus；C，F.Vastus lateralis；Histogram without superscript letters are not significantly different(P>0.05).

2.5 低蛋白日糧對肌源性調節因子mRNA 表達量的影響

如圖3所示，低蛋白日糧對背最長肌MYOD、MYF5、MYF6、MYOZ1、MYL和SIX基因相對表達量均無顯著影響(P>0.05)。在半腱肌中，低蛋白組MYOD基因的相對表達量顯著降低(P<0.05)，而MYF5、MYF6、MYOZ1、MYL和SIX等基因無顯著差異(P>0.05)。在股外側肌肉中，低蛋白日糧對MYOD、MYF5、MYF6、MYOZ1、MYL和SIX等基因的相對表達量均無顯著影響(P>0.05)。

A.背最長肌；B.半腱?。籆.股外側肌；柱狀圖未標記記字母的為差異不顯著(P>0.05)；標記不同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。A.Longissimus dorsi；B.Semitendinosus；C.Vastus lateralis；Histogram without superscript letters are not significantly different(P>0.05)，with different small letters indicate significant difference(P<0.05).

3 討論與結論

本試驗結果顯示，低蛋白日糧組總增質量降低但終末體質量與對照組無顯著差異，這與30%采食量限制綿羊以及母牛日增質量的研究結果一致[17-18]。而低蛋白飼糧組平均日增質量出現了負值，也表明了本試驗低蛋白水平日糧對湘東黑山羊的生長發育的負面影響。

肌纖維是動物肌肉組織的基本組成物質，出生后隨著機體的生長發育，肌肉組織的主要變化體現為肌纖維直徑、橫截面積和長度的增長[25-27]。動物肌肉的生長主要依靠肌纖維中蛋白質含量的增加。有研究發現，高蛋白水平相比于低蛋白水平肌纖維面積略有增大，高蛋白水平可以更好地促進肌肉的生長[28-29]。本試驗中，半腱肌、背最長肌和股外側肌3個部位纖維類型無顯著變化，僅發現半腱肌中肌纖維總平均橫截面積有降低的趨勢，說明了低蛋白日糧不影響肌纖維類型的轉化。半腱肌肌纖維橫截面積降低與侯生珍等[27]在藏羔羊中的研究相近，肌纖維面積隨蛋白水平提高而增大。

肌肉氨基酸含量是反映肌肉品質的重要指標，其各類氨基酸的含量和比例影響肌肉風味和鮮香味[30-31]。絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸等都是山羊肉類營養和風味的重要前體物[32-33]。本試驗結果顯示，低蛋白日糧組背肌中各類氨基酸和總氨基酸含量均無顯著差異，而在股外側肌中低蛋白組的谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸和總必需氨基酸含量顯著降低，低蛋白組的半腱肌中谷氨酸含量顯著降低，這也反映了低蛋白日糧導致的肌肉氨基酸沉積減少。本試驗中對照組的必需氨基酸含量普遍高于低蛋白組，尤其是在股外側肌中低蛋白組的4種必需氨基酸和總必需氨基酸含量顯著降低，表明在較低蛋白水平下湘東黑山羊肌肉氨基酸分解代謝較多，肌肉營養品質和風味水平降低。肌肉蛋白的分解不僅可以提供能量，分解產生的氨基酸也可以被機體用作合成其他關鍵新蛋白的原料。本試驗中背最長肌、半腱肌和股外側肌3個部位的氨基酸含量的差異性，也說明了日糧蛋白攝入不足時肌肉組織分解的偏向性，表現為股外側肌>半腱肌>背最長肌。肌源性決定因子(MYOD)和肌源因子5(MYF5)對肌肉蛋白質合成和肌肉生長具有重要作用[34-35]，本試驗中低蛋白組半腱肌MYOD表達量顯著降低，間接說明了低蛋白日糧下半腱肌蛋白沉積減少而分解增多。

肌肉脂肪組織和肌肉必需脂肪酸的組成直接影響肌肉的營養品質，決定肌肉組織的氧化穩定性和肌肉組織的堅硬度，從而直接影響肌肉的營養風味、嫩度和顏色[36]。研究發現，提高日糧能量水平和蛋白水平直接導致肌肉中飽和脂肪酸(SFA)含量下降，而單不飽和脂肪酸(MUMA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)含量上升[37-38]。本試驗低蛋白組試驗結果與以上類似，背最長肌肉豆蔻酸(C14∶0)含量升高，而油酸(C18∶1n9c)含量下降；半腱肌多不飽和脂肪酸(C20∶2、C22∶1n9)含量下降；股外側肌中，低蛋白日糧處理降低了油酸(C18∶1n9c)、花生四烯酸(C20∶4n6)以及總多不飽和脂肪酸的含量。多不飽和脂肪酸作為必需脂肪酸，對機體免疫和細胞膜功能有積極作用[39]。不飽和脂肪酸在一定程度上與肌肉風味相關，C18∶2n6c、C18∶3n3和C20∶5n3與風味呈負相關，C20∶4與風味呈正相關[40]。本試驗結果表明，低蛋白日糧在一定程度上降低了湘東黑山羊肌肉中不飽和脂肪酸的含量，進而影響肌肉風味。

本試驗條件下，低蛋白日糧(CP：5.52%)降低飼料轉化率，提高屠宰后24 h的肌肉的亮度，但不影響肌纖維類型的轉化與橫截面積。但蛋白攝入不足會影響減少肌肉中氨基酸的沉積，同時減少多不飽和脂肪酸的沉積，最終影響黑山羊肌肉的風味，在生產上對山羊肉質產生不利影響。