胃腸道間質(zhì)瘤中GNG13的表達(dá)及其臨床意義

楊 珺，施維佳，趙 靖，賈宇新，倪 輝

胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST)是消化道最常見的間質(zhì)性腫瘤，主要起源于Cajal間質(zhì)細(xì)胞，由梭形細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞和多形性細(xì)胞組成。其發(fā)病部位50%～70%位于胃部，20%～30%位于小腸[1]。GIST的臨床診斷主要依賴于病理學(xué)分型和基因突變檢測，大多數(shù)GIST含有c-Kit或PDGFRA基因突變[2]。手術(shù)是GIST臨床治療的最佳方法。然而，GIST可從良性轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒裕黾有g(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)期預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)[3]。目前，GIST具體發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。近期研究發(fā)現(xiàn)[4]，細(xì)胞間遞質(zhì)和激素分泌異常是神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和惡性腫瘤的重要特征之一，受G蛋白偶聯(lián)膜受體的調(diào)控。GIST存在多種神經(jīng)內(nèi)分泌表型，其中G蛋白偶聯(lián)膜受體高表達(dá)，G蛋白具有識別激素、改變代謝物水平和傳遞神經(jīng)信號等多種生物學(xué)活性[5]。G蛋白亞單位γ13(G protein subunit gamma 13, GNG13)是重要亞型，在機(jī)體的正常生理功能和器官發(fā)育中發(fā)揮重要作用[6]，但其在胃腸道腫瘤中的作用尚不清楚。本文著重探討GIST組織中GNG13的表達(dá)及與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，為GIST的診斷和治療提供新的生物學(xué)標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2011年2月～2016年2月江蘇省人民醫(yī)院溧陽分院/溧陽市人民醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)確診的122例GIST患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>18歲；(2)符合GIST病理學(xué)和基因突變的診斷；(3)手術(shù)完整切除腫瘤組織和鄰近5 mm癌旁正常組織切緣均為陰性；(4)取得患者的知情同意權(quán)，經(jīng)江蘇省人民醫(yī)院溧陽分院/溧陽市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，臨床資料均完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前有放化療、基因靶向治療史；(2)合并胃腸道惡性腫瘤、消化性潰瘍等胃腸道疾病；(3)嚴(yán)重肝腎功能障礙、自身免疫性疾病、營養(yǎng)代謝性疾病；(4)免疫組化結(jié)果被污染，無法分析。

1.2 方法將術(shù)中完整切除的GIST組織和癌旁正常組織快速冷凍處理，常規(guī)制作石蠟組織，5 μm厚切片。采用免疫組化EnVision法檢測組織中GNG13的表達(dá)，具體操作步驟：切片經(jīng)脫蠟、水化和抗原修復(fù)后，加入3%H2O2溶液和正常山羊血清工作液，27 ℃孵育30 min以封閉抗體，提高組織顯色效率；依次滴加鼠抗人GNG13抗體一抗(江蘇碧云天公司，工作濃度1 ∶2 000)，置于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，以正常小鼠IgG代替一抗作為陰性對照；洗滌干凈后滴加兔抗鼠IgG抗體二抗(江蘇碧云天公司，工作濃度1 ∶500)，置于濕盒中27 ℃孵育20 min；洗滌干凈后滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(江蘇碧云天公司)，置于濕盒中27 ℃孵育20 min；經(jīng)洗滌后加入DAB顯色液，鏡下觀察。

采用半定量法計(jì)算，GNG13陽性主要定位于細(xì)胞質(zhì)，根據(jù)陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度、陽性細(xì)胞百分率進(jìn)行評分：按陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度將陰性“-”計(jì)為1分、弱陽性“+”計(jì)為2分、中等陽性“”計(jì)為3分和強(qiáng)陽性“”計(jì)為4分；按陽性染色細(xì)胞百分比將≤5%計(jì)為0分、6%～25%計(jì)為1分、26%～50%計(jì)為2分、>50%計(jì)為3分；兩項(xiàng)得分相乘，其中0～3分為低表達(dá)，4～12分為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier生存曲線分析總生存期(overall survival, OS)，組間比較采用Log-rank χ2檢驗(yàn)；單因素和多因素Cox回歸分析影響OS的危險(xiǎn)因素；采用逐步后退法，以雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GIST和癌旁正常組織中GNG13的表達(dá)免疫組化檢測結(jié)果顯示，GIST組織中GNG13的高表達(dá)率(73.8%，90/122)明顯高于癌旁正常組織 (11.5%，14/122)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=96.796，P<0.001，圖1)。

圖1 GNG13的表達(dá)，EnVision法：A.胃腸道間質(zhì)瘤中GNG13呈陽性；B.癌旁正常組織中GNG13呈陰性

2.2 GIST中GNG13表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系GIST中GNG13高表達(dá)組腫瘤直徑和有絲分裂指數(shù)、DOG1和CD117表達(dá)，均明顯高于GNG13低表達(dá)組(P<0.05)。其他指標(biāo)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 胃腸道間質(zhì)瘤中GNG13表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 GIST中不同組間的預(yù)后比較Kaplan-Meier生存曲線顯示，GIST中GNG13高、低表達(dá)組與腫瘤直徑、有絲分裂指數(shù)的5年OS相關(guān)(P<0.05，表2，圖2)。

表2 胃腸道間質(zhì)瘤中不同組間的預(yù)后比較

圖2 胃腸道間質(zhì)瘤患者的預(yù)后分析：A.GNG13表達(dá)與總生存期的關(guān)系；B.腫瘤直徑與總生存期的關(guān)系；C.有絲分裂指數(shù)與總生存期的關(guān)系

2.4 GIST預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析將GIST的臨床和病理特征作為自變量，生存或死亡作為因變量進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析。本組結(jié)果顯示GNG13高表達(dá)、腫瘤直徑和有絲分裂指數(shù)增加均是GIST患者5年OS降低的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05，表3)。

表3 胃腸道間質(zhì)瘤預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

3 討論

GIST是胃腸道最常見的良性腫瘤，早期手術(shù)可徹底根治，復(fù)發(fā)率通常較低，術(shù)后放、化療對腫瘤復(fù)發(fā)、耐藥和轉(zhuǎn)移者的治療效果較差[7]。分子靶向藥物如伊馬替尼、舒尼替尼對復(fù)發(fā)性GIST有一定聯(lián)系，改善臨床轉(zhuǎn)歸[8]。GIST的基因突變類型復(fù)雜多樣，可能與患者的臨床特點(diǎn)及預(yù)后密切相關(guān)[9]，隨著研究的深入，更多的突變位點(diǎn)被識別和檢測，對提高腫瘤臨床療效以及預(yù)后轉(zhuǎn)歸有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GIST組織中GNG13高表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織(73.8%vs11.5%，P<0.001)，提示GNG13高表達(dá)可能參與GIST的進(jìn)展。GIST具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的腫瘤特性，腫瘤細(xì)胞中含有多種跨膜受體，其功能表達(dá)需要G蛋白介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終實(shí)現(xiàn)靶向基因和蛋白的表達(dá)[10-12]。G蛋白的分子結(jié)構(gòu)由α、β和γ亞基組成，Gγ分子亞基可以獨(dú)立介導(dǎo)細(xì)胞外信號向細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞核傳導(dǎo)，并參與有絲分裂和細(xì)胞膜等過程運(yùn)輸[13-14]。GNG13是由人類16號染色體上的GNG13基因座編碼的Gγ分子，由3個(gè)3.5 kb外顯子和984 bp開放閱讀框組成，起始于外顯子2終止于外顯子3。GNG13在嗅覺、味覺和視網(wǎng)膜神經(jīng)元中大量表達(dá)，并與小鼠的攻擊行為密切相關(guān)[15-16]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，GNG13高表達(dá)組腫瘤直徑和有絲分裂指數(shù)、DOG1和CD117表達(dá)，均明顯高于GNG13低表達(dá)組(P<0.05)；提示GNG13高表達(dá)主要參與腫瘤的有絲分裂和細(xì)胞增殖過程。DOG1和CD117也被認(rèn)為是GIST重要腫瘤標(biāo)志物，GNG13與DOG1、CD117之間的關(guān)系尚不清楚。在GNG13高表達(dá)組中DOG1和CD117表達(dá)亦明顯增多，提示GNG13是GIST發(fā)生的重要生物學(xué)標(biāo)志物。文獻(xiàn)報(bào)道G蛋白亞單位參與調(diào)節(jié)器官發(fā)育、生理功能以及腫瘤的發(fā)生，其中Gγ由12個(gè)亞基組成：Ⅰ類包括Gγ7和Gγ12，Ⅱ類包括Gγ2、Gγ3、Gγ4和Gγ8，Ⅲ類包括Gγ5和Gγ10，Ⅳ類包括Gγ1、Gγ9和Gγ11，Ⅴ類包括Gγ13。Gγ1主要通過丙戊酸鈉途徑控制果蠅心臟的形成，并與生殖細(xì)胞的遷移有關(guān)[17-19]。Gγ11通過ERK1/2進(jìn)一步激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信號通路，促進(jìn)細(xì)胞衰老和凋亡的發(fā)生[20-21]。GNG11通過誘導(dǎo)活性氧和異常細(xì)胞核形態(tài)進(jìn)而抑制人肺成纖維細(xì)胞系SUSM-1細(xì)胞的惡性增殖[22-23]。Gγ家族在細(xì)胞正常生長發(fā)育和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。如GNG7在胰腺癌、胃癌和結(jié)直腸癌中表達(dá)較低，且GNG7是霍奇金淋巴瘤發(fā)生的重要抑制因子[24-26]。啟動子甲基化抑制GNG7可以明顯降低頭頸部腫瘤和食管癌體外細(xì)胞的惡性增殖和遷移能力[27-28]。Montemagno等[29]報(bào)道NeoB是靶向胃泌素釋放肽受體(gastrin releasing peptide receptor, GRPR)的放射性示蹤劑，GRPR是在多種癌癥中表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體，利用NeoB能夠較準(zhǔn)確評估GIST中的GRPR分布情況以及評估靶向療效。

本實(shí)驗(yàn)顯示，GIST中GNG13高、低表達(dá)組與腫瘤直徑、有絲分裂指數(shù)的5年OS相關(guān)(P<0.05)；提示三者可能導(dǎo)致GIST預(yù)后不良。采用單因素和多因素Cox回歸分析顯示，GNG13高表達(dá)、腫瘤直徑和有絲分裂指數(shù)增加均是5年OS降低的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。DOG1和CD117在多因素回歸分析中并未顯示與OS的關(guān)系，考慮與納入樣本量和患者的臨床特征有關(guān)。GNG13在多因素Cox回歸分析中仍顯示與OS有緊密聯(lián)系，提示GNG13表達(dá)上調(diào)與GIST的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)。GNG13高表達(dá)與GIST的惡性表型有關(guān)，原發(fā)性GIST最重要的預(yù)后因素有腫瘤直徑、有絲分裂指數(shù)、原發(fā)部位和AFIP-Miettinen危險(xiǎn)分級，但該研究未觀察到原發(fā)部位和AFIP-Miettinen危險(xiǎn)分級與GIST的臨床預(yù)后有關(guān)，可能與樣本量和觀察時(shí)間有關(guān)。有研究指出[30]，相同腫瘤直徑、有絲分裂指數(shù)的GIST臨床預(yù)后可能不同，提示GIST的發(fā)生、發(fā)展與多種因素相關(guān)，尤其是分子水平。本實(shí)驗(yàn)的意義在于發(fā)現(xiàn)GIST組織中GNG13高表達(dá)，可能是腫瘤發(fā)生和預(yù)后的重要參與機(jī)制。

綜上所述，GNG13高表達(dá)可能參與GIST的發(fā)生、發(fā)展，與腫瘤直徑和有絲分裂指數(shù)增加有關(guān)，是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可作為早期診斷GIST和評估臨床預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)首次提出GNG13高表達(dá)可能參與GIST的發(fā)生、發(fā)展，為腫瘤診斷、靶向治療以及評估預(yù)后提供重要參考。由于本組病例數(shù)和觀察時(shí)間有限，還需積累更多病例進(jìn)一步分析。本課題組后續(xù)將通過體外細(xì)胞和動物模型，進(jìn)一步分析GNG13參與GIST發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制。